研究背景食管癌发生于食管粘膜上皮的基底细胞,是最常见的消化道恶性肿瘤之一,全世界每年约有28万人死于食管癌。我国是食管癌的高发地区,其发病率和死亡率仅此于胃癌,发病率目前居世界第一位,同时我国也是食管癌中死亡率较高的国家之一。食管癌的病理类型分为鳞状细胞癌和腺癌,在我国,约90%以上的食管癌病理类型为鳞癌,而在西方国家,其主要的病理类型由之前的鳞癌逐渐转变为腺癌,且发病率亦呈上升趋势。目前食管癌的治疗手段是以手术、放疗、化疗等组成的综合治疗方式,其中早期食管癌的治疗以手术治疗为主,但对多数患者来说,诊断时即为晚期,已发生远处转移,失去手术根治机会,即使可以手术,多数患者在术后发生肿瘤复发和转移,部分患者甚至不能耐受放化疗。整体上来说,食管癌的预后较差,总的死亡率高达88%。对于晚期食管癌患者,单一的治疗方式如手术、局部放疗、化疗、光动力治疗各自存在不足之处,为了减少治疗的风险,获得最大的治疗受益,应采取综合治疗的策略。光动力治疗光动力疗法(Photodynamic therapy, PDT)是由特定波长的激光激发辐射特定肿瘤组织的光敏剂,产生其他的活性氧类(ROS)物质及单态氧分子,对局部的肿瘤细胞及组织产生光损伤,诱导细胞发生凋亡、坏死、自噬。PDT广泛应用于食管癌及癌前病变如Barrett’s食管的治疗,对早期食管癌可以达到根治效果,对局部晚期食管癌产生梗阻症状等有较好的姑息作用。光动力学疗法作为一种有效的微创治疗手段,不同于传统的治疗肿瘤手段手术、放疗和化疗,它对靶组织有一定选择性,对正常组织的损伤较小。还有创伤小,毒性低微,可重复治疗,可起到姑息治疗作用的优点,可与其他治疗手段产生协同作用提高疗效,并可消灭隐性病灶,大大减少肿瘤复发的机会,重要的是光动力疗法可保护容貌及重要器官外形和功能,而且光动力治疗可以在门诊实施,减少病人的不便及住院费用。但是,由于各种原因在临床中光动力治疗的效果并不稳定,所以探讨光动力治疗的作用机制,寻找新的有效的治疗方向和靶点,以提高光动力治疗的疗效,对改善食管癌的预后有重要的意义。PDT治疗肿瘤的作用机制很复杂,概括起来,大致包括光动力效应对肿瘤细的直接损伤作用、破坏肿瘤内微血管引起肿瘤细胞缺氧、诱导肿瘤细胞凋亡、引起局部和全身的免疫反应改变等多方面的影响,诸多影响的综合作用最终造成肿瘤细胞死亡。主要通过凋亡和坏死两种方式引起肿瘤细胞死亡,而以何方式为主则取决于激发光源照射量,光敏剂的种类、浓度、孵育方式及其亚细胞定位,肿瘤细胞的类型等。Photofrin是第一代光敏剂,定位于内质网和高尔基体,可导致细胞发生凋亡和坏死,同时导致凋亡相关基因及蛋白的表达变化,其中,细胞凋亡是一种更有效的细胞死亡方式。PDT主要通过两条通路诱导细胞凋亡：由死亡受体介导的外部通路和线粒体介导的内部通路。线粒体内部凋亡通路,是通过细胞外的某些信号或细胞内DNA的损伤引起凋亡相关基因,主要为BCL-2家族成员(如BCL-2,BAX等)发生蛋白水解、脱磷酸化等修饰而活化,然后由细胞浆向线粒体膜移位,出现线粒体膜电位降低,从而引起线粒体内膜及其内膜间隙的凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF).凋亡分子如cytc等释放到胞质内,激活caspase-3.caspasse-6等,水解核内的多聚ADP核糖多聚酶(poly adenosine diphosphate-ribose polymerase,PARP).核纤层蛋白(1amins)等,最终启动凋亡通路的终末效应诱导细胞凋亡发生。在PDT诱导细胞凋亡过程中,凋亡相关的基因及蛋白表达可发生明显的变化。细胞凋亡是一个由多个相关基因参与的复杂的生命过程,其中BCL-2家族是参与细胞凋亡调控的重要家族,该家族中的BCL-2和BCL-XL有抗凋亡作用,BAX和BAD等则具有促进凋亡的作用。BCL-2是重要的抗凋亡成员,可抑制氧化应激,影响钙离子内流,以及抑制线粒体细胞色素c的释放、稳定线粒体膜电位和通过抑制半胱氨酸酶活性等多种机制来抑制凋亡。Photofrin介导的光动力作用主要通过由线粒体介导的凋亡途径诱导细胞凋亡,BCL-2家族在肿瘤细胞凋亡过程中起着非常重要的作用,相关研究显示BCL-2基因及蛋白的表达在PDT后24h均显著下调,表明BCL-2可能为该凋亡通路的靶基因之一。相关研究表明,通过上调或下调BCL-2的表达可增强光动力效应,但其在Photofrin-PDT食管癌光动力治疗中的具体作用机制还不清楚。光敏素Ⅱ (Photofrin)是第一代光敏剂,是从血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative, HPD)中分离出的具有较强光生物学活性部分。早在1993年Photofrin首先被批准应用于膀胱癌的光动力治疗,随后逐步应用于多种良恶性疾病的治疗。临床中最常采用630nm波长的激光为光源照射。虽然Photofrin的成分复杂,皮肤光毒性作用持续时间较长,其仍然是目前在临床上广泛应用的光敏剂之一。本课题选择第一代光敏剂Photofrin,通过体外实验研究Photofrin-PDT在食管癌的抑制生长效应,确定合适的实验条件,探讨其最佳作用参数,为临床光动力治疗条件的选择提供一定依据。通过干扰人食管癌细胞中BCL-2基因的表达,探讨在BCL-2基因低表达情况下,Photofrin介导的光动力治疗对食管癌细胞凋亡及凋亡相关基因和蛋白的表达的影响。研究目的1.通过研究Photofrin-PDT对食管癌细胞的体外效应,探讨Photofrin-PDT的最佳作用参数；2.通过构建干扰序列,瞬转干扰食管癌细胞Eca-109中BCL-2基因表达,然后进行Photofrin-PDT治疗。研究BCL-2基因的低表达对食管癌Photofrin-PDT治疗中,细胞凋亡及相关凋亡基因BCL-XL、BAX和蛋白caspase-3、cytc的表达变化的影响,以初步探讨BCL-2表达状况对食管癌光动力治疗的影响。研究方法及内容1.MTT法检测Photofrin-PDT对食管癌细胞Eca-109的光动力效应：实验分为空白对照组和光动力治疗组,光动力治疗组分别给予不同浓度的Photofrin (0.01ug/ml,0.75ug/ml,1.5ug/ml,3.0ug/ml,6.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/ml)和不同孵育时间(分别孵育4h、6h、12h、24h)后于饱和光剂量下(20J/cm2)进行光照,采用DIOMED630PDT光源系统,照光后继续孵育24小时后,通过MTT法检测细胞生存率。2.脂质体转染法干扰BCL-2基因的表达：构建BCL-2siRNA干扰序列,脂质体转染细胞,干扰Eca-109细胞BCL-2基因的表达。使用荧光定量PCR及免疫印迹实验筛选验证有效干扰片段。3. AnnexinV-FITC/PI双标检测干扰Eca-109细胞BCL-2基因表达后,Photofrin-PDT对细胞凋亡的影响：实验分为干扰联合光动力治疗组、光动力治疗组和对照组。干扰联合光动力治疗组和光动力治疗组加入Photofrin并使其终浓度为5ug/ml,避光培养6小时后采用DIOMED630PDT光源系统进行光照(功塞200mW/cm2,照光150s,光剂量20J/cm2)。照光后继续避光孵育24小时,收集细胞后分别加入AnnexinV-FITC (5ul)和PI (5ul),避光孵育10min后经流式细胞仪检测凋亡情况。4.实时定量PCR法检测干扰细胞BCL-2基因表达同时给予光动力治疗后BAX, BCh-XL的基因表达变化：实验分为干扰联合光动力治疗组、光动力治疗组和对照组。前两组细胞给予Photofrin(调整其终浓度为5.0ug/ml)孵育24小时后行光照(功率密度200mW/cm2,照光150s,光剂量20J/cm2)。照光后继续孵育24小时,然后收集细胞,提取总RNA,经逆转录体系转录得到cDNA,根据SYBR荧光定量试剂指示,于ABI7500PCR仪上检测BAX, BCL-XL的基因表达变化情况。5. Western Blot法检测干扰细胞BCL-2基因表达同时给予光动力治疗后Caspase-3、cytc(胞浆)蛋白含量的变化：实验分为干扰联合光动力治疗组、光动力治疗组和对照组。前两组细胞给予Photofrin (终浓度为5.0ug/ml)孵育24小时后进行光照(功率密度200mW/cm2,照光150s,光剂量20J/cm2)。照光后继续孵育24小时,收集细胞后分别提取细胞总蛋白和胞浆蛋白,通过Western Blot检测Caspase-3、cytc蛋白含量的变化。6.统计分析：相关实验数据采用spss13.0统计软件进行统计处理。实验结果以“均数±标准差”表示。细胞生存率的统计分析采用析因设计的方差分析。细胞凋亡以及细胞生存率比较均采用单向方差分析。基因及蛋白相对表达量的分析均采用独立样本t检验。P值<0.05时认为差异有统计学意义。结果1、Photofrin浓度对PDT导致的肿瘤细胞生长抑制的影响：从PDT后细胞生长曲线可见,随着Photofrin孵育浓度的增高,细胞存活越少,即Photofrin-PDT对细胞生长的抑制越大。但当其浓度由lOug/ml加至20ug/ml时OD值未见明显下降。2.多种因素可影响Photofrin-PDT对Eca-109细胞的增殖抑制作用：不同孵育时间及不同浓度作用下细胞的生存率有显著差异(P<0.01)。同一孵育时间不同孵育浓度下,细胞生存率均有显著差异(P<0.01),同一孵育浓度下不同孵育时间的生存率,则除了浓度为0. Olug/ml和0.75ug/ml无显著差异外,其余均有显著差异(P<0.05)。当Photofrin孵育浓度为10. Oug/ml,孵育时间为24小时细胞生存率最低。而当孵育浓度由10. Oug/ml增至20ug/ml时,孵育时间由12小时延长至24时时,并不能提高其抑制效应。3.BCL-2干扰联合光动力治疗对人食管癌细胞Eca-109具有促进凋亡的作用：FCM结果显示,光动力治疗组与对照组相比,凋亡率有显著差异(P<0.05),干扰联合光动力治疗组细胞主要发生早期凋亡,凋亡率与光动力治疗组相比提高且有显著差异(P<0.05)。4.BCL-2干扰联合光动力治疗通过影响BCL-2下游的凋亡相关基因的表达促进细胞凋亡的发生：BCL-2干扰联合光动力治疗组和光动力治疗组的BCL-XL的表达水平在Photofrin-PDT作用于Eca-109细胞24h后均显著下调,而BAX的表达水平则显著上调,两者与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。干扰联合光动力治疗组和光动力治疗组相比,BCL-XL、BAX基因的表达水平在Photofrin-PDT作用于Eca-109细胞后的变化均有统计学意义(P<0.05)。5.BCL-2干扰联合光动力治疗通过促进cytc蛋白释放促进细胞凋亡：BCL-2干扰联合光动力治疗组和光动力治疗组的Caspase-3和胞浆中cytc蛋白在Photofrin-PDT作用于Eca-109细胞24h后表达均显著上调,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,干扰联合光动力治疗组与光动力治疗组相比,Caspase-3和胞浆中cytc蛋白表达水平变化在Photofrin-PDT作用于Eca-109细胞24h后均有统计学意义(P<0.05)。结论1. Photofrin-PDT对Eca-109细胞有显著的增殖抑制作用。要达到Photofrin-PDT的最佳杀伤效应,需选择合适的作用条件。2. Photofrin-PDT可以促进Eca-109细胞发生凋亡及坏死,干扰Eca-109细胞BCL-2基因表达后,可以影响BCL-2下游凋亡信号通路,促进细胞凋亡,导致Photofrin-PDT处理后Eca-109细胞发生早期凋亡为主的死亡,细胞凋亡率较未干扰细胞升高。3.BCL-2为食管癌Photofrin-PDT作用过程中的重要靶点。