家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,BmBDV)是首例二分DNA病毒,该病毒是2012年国际病毒分类委员会(ICTV)新设立二分DNA病毒科的唯一病毒种。BmBDV是一种病原可以引发家蚕罹患类似昆虫浓核症,主要侵染家蚕的柱状细胞。该病毒结构类似细小病毒,但复制方式却与腺病毒相似,BmBDV兼具浓核病毒及腺病毒双重特性。Bm BDV具有基因载体和生物杀虫剂的潜能,但是病毒拯救一直是该病毒应用研究的瓶颈。在这个研究中我们找到了BmBDV病毒拯救新的突破点,构建BmBDV可恢复线性末端结构的全基因组克隆和携带gfp报告基因的重组Bm BDV基因克隆,使用酶切线性化的方法分别共转染家蚕BmN细胞并采用持续培养和扩大培养的细胞培养方式。使用光学显微镜和倒置荧光显微镜观察共转染的Bm N细胞病变情况和外源绿色荧光蛋白gfp基因的表达情况,使用甲基化DNA分析检测的方法,检测线性化共转染的Bm N细胞中是否有子代病毒DNA的合成,使用RT-PCR检测方法检测线性化共转染的Bm N细胞中病毒基因组是否可以转录,使用Western blot蛋白检测方法,检测线性化共转染的Bm N细胞中病毒基因组和外源基因是否可以表达。使用病变的BmN细胞裂解悬浮液添食易感品系的家蚕幼虫的方法,检测共转染的Bm N细胞是否可以产生具有感染性的病毒粒子。构建可恢复病毒基因组末端结构的全长克隆质粒。即在构建BmBDV全基因组克隆pUC-VD1/p,pUC-VD2/p时,在共有末端序列前引入CAC三个核苷酸,在基因组末端创造一个限制性内切酶PmaCI特异性识别序列CACGTG。构建携带报告基因gfp重组质粒pVD2-mcp/gfp,即在病毒次要衣壳蛋白mCP基因内插入gfp基因独立表达盒P5-gfp-sv40。通过酶切获得线性化病毒基因组片段,脂质体包埋线性化基因组共转染Bm N细胞。持续培养15d,进行了质粒病毒基因组的家蚕细胞系转染和拯救研究。普通光学显微镜下在转染全基因组片段和重组病毒质粒酶切片段的Bm N细胞中可以观测到细胞形状发生改变,开始变圆并伴随细胞破裂明显细胞病变现象,转染重组病毒质粒酶切片段的Bm N细胞在倒置荧光显微镜下可以观测到外源绿色荧光蛋白基因gfp的表达。对病变BmN细胞沉淀,使用甲基化DNA分析检测的方法,检测到子代病毒DNA可以在转染的Bm N细胞中合成,说明病毒基因组可以在线性化共转染病变的Bm N细胞中复制。使用RT-PCR检测方法,可以在共转染病变的Bm N细胞中检测到病毒基因组NS1基因的mRNA,说明线性化共转染病变的Bm N细胞中病毒基因组可以转录。使用Western blot蛋白检测方法,检测到线性化全基因组共转染的BmN细胞总蛋白中有病毒基因组结构蛋白vp基因的表达。在线性化重组病毒基因组共转染的Bm N细胞总蛋白中还可以检测到外源基因gfp基因的表达。VP蛋白是BmBDV最主要的结构蛋白,VP蛋白的表达为病毒基因组在细胞中的包装提供了一定的基础。GFP蛋白是外源基因表达的可视化蛋白,GFP蛋白的表达为BmBDV发展为病毒载体提供了可能性。将病变Bm N细胞裂解液添食回感易感品系家蚕一龄蚁蚕,幼虫表现出了典型的浓核症状,中肠组织开始变细变黄,出现了明显的组织病变现象,并且中肠组织在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,结果说明在线性化共转染的Bm N细胞产生了具有感染性的病毒粒子。