登革病毒(dengue viruses, DV)是黄病毒属(Flavivirus)的单股正链RNA病毒。它只有一个开放阅读框(open reading frame,ORF),编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白,从5’端到3’端依次为5’-C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’。登革病毒广泛流行于热带和亚热带地区,主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,引起人类登革热(classical dengue fever, DF)和登革出血热/登革休克综合征(dengue haemorrhagic fever /dengue shock syndrome, DHF/DSS)。近年来,在世界范围内和我国南方及东南亚,DHF/DSS的发病率有明显增加之趋势,可见登革病毒感染已是严重的公共卫生问题。当机体受到病毒感染等不利条件攻击时,活性氧(reactive oxygen species,ROS)就会产生过多,超过机体的清除能力,导致ROS在体内堆积并引起组织细胞氧化损伤。这一病理过程则称为氧化应激(Oxidative Stress, OS)。细胞内存在着许多抗氧化物质,谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是其主要成员之一。它是细胞内一种含巯基的小分子抗氧化剂,是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的天然小分子三肽,是体内重要的氧化还原缓冲系统。它与多种抗氧化酶以及抗氧化剂组成机体的抗氧化网络,维持机体的氧化-抗氧化平衡。病毒进入细胞后,利用宿主细胞的能量代谢系统进行自身大分子生物合成,这样宿主细胞正常代谢和生理功能被打乱,导致细胞自身的氧化-抗氧化平衡被打破。有文献报道流行性感冒病毒、人类免疫缺陷病毒感染能够增加细胞内氧化剂含量和抑制抗氧化剂合成,使细胞氧化水平升高,抗氧化能力下降,细胞内GSH下降,进而影响宿主细胞氧化还原状态。但登革病毒感染是否引起宿主细胞氧化还原状态的改变尚无见文献报告。因此,我们以对登革病毒易感染的肝癌细胞株HepG2细胞为研究对象,重点探讨了登革病毒及其3个结构蛋白C、prM和prM/E和重要的非结构蛋白(nonstructural protein 3,NS3)蛋白在与宿主细胞相互作用过程中细胞内GSH的变化,以此反映宿主细胞氧化还原状态的改变。本研究主要结果与结论如下:1. DV NS3抗血清的制备利用RT-PCR以DV mRNA为模板扩增出DV NS3编码基因NS3。将NS3全长基因插入原核表达载体pQE31,转化大肠杆菌JM109,获得的pQE-NS3/ JM109工程菌经IPTG诱导后,超声裂解提取表达产物,融合蛋白NS3以包涵体的形式存在。包涵体裂解液经Ni-NTA亲和纯化后,获得大小相符的特异目标蛋白条带。经Western blot证实为所需目的蛋白。目的蛋白经纯化复性后免疫新西兰大耳白兔和Balb/c小鼠,获得了抗体效价较高的抗血清,经ELISA检测,兔抗血清效价达到了1:12800,小鼠抗血清的效价也达到1:6400。利用Western blot和间接免疫荧光证实,抗血清能特异性地识别病毒蛋白NS3。NS3抗血清的成功制备为进一步研究NS3在登革病毒感染病理机制中的作用提供良好的工具,也为部分登革病毒感染的诊断提供一种辅助手段。2. pRE-NS3/HepG2稳定表达细胞株的构建通过PCR扩增出DV NS3编码基因。将NS3全长基因插入表达载体pReceiver,转化大肠杆菌JM109,获得pRE-NS3/ JM109工程菌。超纯提取质粒pRE-NS3 DNA后,利用脂质体法转染细胞HepG2,经G418筛选、克隆、间接免疫荧光和Western blot鉴定,获得了稳定表达NS3蛋白的HepG2细胞株,命名为:pRE-NS3/HepG2。同时,构建了含空载体pReceiver的HepG2细胞株作为对照。命名为:pReceiver/HepG2。3. DV感染后HepG2细胞内GSH的测定DV感染HepG2细胞(MOI=10)24h后, PBS充分洗涤细胞,胰蛋白酶消化,取出细胞。经过四次快速冻融,离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现,病毒感染24h后,细胞内GSH的浓度较未感染细胞下降了32.8%,二者比较有显著性差异(P < 0.01)。说明DV感染能使HepG2细胞内GSH水平下降,改变宿主细胞的氧化还原状态。4. DV NS3、C、prM和prM/E蛋白对宿主细胞内GSH的影响以上我们证明了DV感染能够使HepG2细胞内GSH水平下降,由此推测构成DV的3个结构蛋白和7个非结构蛋白可能参与了这一过程,为此我们选择了非结构蛋白中的NS3和3个结构蛋白,初步研究了它们对细胞氧化还原状态的影响。首先,将pRE-NS3/HepG2细胞和pReceiver/HepG2细胞接种6孔板,待细胞单层铺满后,PBS充分洗涤细胞,胰蛋白酶消化,取出细胞。四次快速冻融,离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现,pRE-NS3/HepG2细胞内GSH的浓度与对照细胞相比下降了20.9%,与转染空质粒的对照细胞pReceiver/HepG2比较,有显著性差异(P < 0.01)。利用同样方法检测,我们发现DV的3个结构蛋白C、prM和prM/E蛋白也能使宿主细胞内GSH的浓度下降,与对照细胞相比分别下降了34.5%、30.1%、32.8%,且有显著性差异(P < 0.05)。三种结构蛋白之间相比无显著性差异(P﹥0.05)。其它非结构蛋白对细胞氧化还原状态的影响正在研究之中。以上结果表明,登革病毒感染HepG2细胞后,细胞内的GSH浓度下降;转染NS3的HepG2细胞和转染C、prM和prM/E蛋白的细胞较转染空质粒的细胞,细胞内GSH浓度也均有下降;结构蛋白下降更为显著。这一结果提示登革病毒蛋白特别是结构蛋白在这一病理过程中可能起主要作用。以上结果为阐明登革病毒的致病机理和进一步设计靶向抗病毒药物提供了初步的实验依据。