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目的:子宫颈癌作为女性第四大恶性肿瘤,严重威胁全世界妇女的生命健康。其分期不同,直接影响患者的生存率,早期子宫颈癌及局部进展期子宫颈癌患者有机会接受常规治疗,预后好,而转移性子宫颈癌患者表现出异质性,生存率低等特点,目前并没有标准的治疗方法。为降低子宫颈癌的死亡率,寻找针对转移性子宫颈癌的有效治疗靶点,成为本课题组研究子宫颈癌的重要方向。过表达的Wolf-Hirschhom综合征候选基因1(Wolf-Hirschhom syndrome candiadate,WHSC1)作为组蛋白赖氨酸甲基化转移酶之一,参与表观遗传的调控,在多种实体瘤的发展过程中起着促进恶变的作用。本研究通过检测WHSC1在子宫颈癌及细胞中的表达、以及在体外实验中,通过敲减WHSC1在C-33A细胞中的表达,来观察其在细胞生长、增殖、侵袭、迁移以及对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)细胞成管的影响,探讨WHSC1在子宫颈癌进展中可能的作用及相关机制。方法:(1)将收集到的96例患者的宫颈组织构建组织芯片(tissue microarray,TMA),采用免疫组化的方法检测72例宫颈癌,6例宫颈上皮内瘤变Ⅲ(cervical intraepithelial neoplasia,CINⅢ),18例慢性宫颈炎组织标本中WHSC1的蛋白表达情况,并分析WHSC1的异常表达与临床病理特征之间的关系。(2)采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的方法检测72例宫颈癌,6例CINⅢ,18例慢性宫颈炎组织标本中WHSC1的mRNA表达情况。(3)蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测Siha细胞、C-33A细胞、HeLa细胞、HEK细胞中WHSC1的蛋白表达情况。(4)qPCR检测Siha细胞、C-33A细胞、HeLa细胞、HEK细胞中WHSC1的mRNA表达情况。(5)设计并化学合成三对含靶向WHSC1基因的重组质粒,并通过双酶切实验和DNA测序对重组质粒进行鉴定。(6)将测序正确的目的基因质粒转染293T细胞,构建慢病毒包装细胞后,收获病毒转染C-33A细胞,并建立筛选出抑制效果最佳的质粒。(7)转染并筛选出稳定转染细胞,采用qPCR及WB分别检测转染组细胞和阴性对照组细胞中WHSC1 mRNA和蛋白表达量的情况,鉴定其WHSC1基因表达抑制效果。(8)CCK-8检测WHSC1敲减后C-33A细胞的生长活力的情况。(9)Transwell检测WHSC1干扰慢病毒感染C-33A细胞后的侵袭、迁移能力的改变。(10)观察WHSC1干扰慢病毒感染C-33A细胞后培养上清液对HUVEC细胞在基质胶上形成血管的影响。(11)WB检测WHSC1干扰慢病毒感染C-33A细胞后与血管生成有关的通路蛋白AKT、VEGF和eNOS表达的情况。结果:(1)WHSC1蛋白表达的阳性率与病变的严重程度呈正相关(P<0.0001),WHSC1 mRNA表达在宫颈癌组织中表达均明显高于慢性宫颈炎组织和宫颈上皮内瘤变的组织(P<0.05),而CIN3与慢性宫颈炎组比较其表达含量无统计学差异(P>0.05)。(2)WHSC1在晚期宫颈癌(≥III期)(P=0.0040)和低分化患者(P=0.0156)中高表达,且有明显统计学意义。而在肿瘤大小(P=0.4999)、淋巴结转移(P=0.5131),以及患者年龄上(P=0.5929)WHSC1的表达均没有统计学差异。(3)WHSC1蛋白高表达的宫颈癌患者其生存率明显低于其低表达的子宫颈癌患者(P<0.05)。(4)WHSC1在子宫颈癌细胞株C-33A、HELA、Siha细胞中的表达均高于正常上皮细胞HEK中WHSC1的蛋白表达量,且C-33A细胞中WHSC1蛋白表达水平最高。(5)C-33A、Siha细胞中WHSC1 mRNA的表达较高,明显高于正常上皮细胞HEK中的表达,而WHSC1 mRNA在HELA细胞中的表达水平较低且低于HEK细胞。(6)成功设计并合成三条WHSC1特异性shRNA,双酶切实验和DNA测序报告显示,基因重组技术成功构建WHSC1基因RNA干扰慢病毒载体。(7)慢病毒介导的WHSC1-shRNA1#、WHSC1-shRNA2#、WHSC1-shRNA3#及阴性对照成功感染C-33A细胞,采用qPCR验证WHSC1抑制的效果,其中以WHSC1-shRNA1#抑制效果最好。(8)WHSC1-shRNA1#转染C-33A细胞获得稳转细胞(WHSC1-KD-1#),qPCR及WB分别检测转染组细胞和阴性对照组细胞中WHSC1 mRNA和蛋白表达,结果显示,目的基因的mRNA和蛋白表达水平均被明显抑制。(9)CCD-8实验中,WHSC1-KD-1#组细胞的增殖在后期与NC组相比受到抑制,在第5、6天时较为明显。(10)Transwell检测WHSC1-KD-1#组细胞与NC组相比,其侵袭能力和迁移能力均减弱。(11)共培养中,WHSC1-KD-1#组细胞培养上清液与HUVEC共培养时,成管作用较NC组有明显抑制作用。(12)敲减WHSC1基因的表达后,AKT、VEGF相应略有降低,但减低不明显,eNOS表达明显升高。结论:(1)在子宫颈癌患者组织中WHSC1的mRNA及蛋白水平均呈现出高表达,并且高表达的WHSC1与分化差、期别晚的子宫颈癌相关,且高表达的WHSC1蛋白与宫颈癌中低生存率者有关。另外,在多种子宫颈癌细胞株中,WHSC1的蛋白表达均高于正常鳞状细胞HEK细胞,其中以C-33A细胞的WHSC1表达增高最为明显。这些结果提示WHSC1可能在子宫颈癌的发展中起着促进作用,但相关机制是什么,还需要进一步探讨。并选择出C-33A细胞作为下一步研究所需的靶细胞。(2)成功构建并筛选出抑制相关最佳的WHSC1基因特异性重组质粒。利用慢病毒载体成功转染并筛选出稳定转染子宫颈癌C-33A细胞株(WHSC1-KD-1#),为进一步研究WHSC1在子宫颈癌发展中的生物学行为及其分子机制奠定了实验基础。(3)WHSC1基因沉默后明显抑制了C-33A细胞的增殖、侵袭及迁移能力。在共培养中,WHSC1基因沉默能显著抑制HUVEC细胞的成管作用。敲减WHSC1基因后,细胞中eNOS蛋白表达明显升高。这些结果提示WHSC1作为重要的遗传表观学调节因子对子宫颈癌增殖、浸润、转移、血管生成等恶性行为中有着重要的促进作用;WHSC1的高表达可能引起AKT-VEGF-eNOS信号通路的异常。因此,WHSC1可望成为一个新的子宫颈癌治疗靶点,进行进一步科学研究。