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背景胆固醇结石是一种常见病、多发病,在西方国家发病率达10%-20%。据统计,在我国胆固醇结石发病率达8%-10%,并且随着生活方式的改变胆固醇结石发病率有逐年上升的趋势,给我们国家的医疗卫生系统带来沉重的经济负担。胆固醇结石被认为是一种多因素共同作用导致的疾病,其中肝脏、胆囊及肠道的代谢异常对胆固醇结石的形成有重要的影响。肝脏是胆汁的主要来源,胆汁的成分主要包括:水、胆汁酸、磷脂(主要是卵磷脂)、胆固醇、钠、钾、钙、磷酸盐、碳酸盐以及少量蛋白质等。其中胆固醇在水中的溶解度很低,主要靠与磷脂、胆酸盐形成微胶粒大大增加其水溶性。胆固醇与磷脂、胆酸盐的相对含量决定了其在胆汁的溶解度,即当胆汁中胆固醇的含量增加或卵磷脂与胆酸盐的含量降低时,微胶粒即处于过饱和状态,过多的胆固醇会结晶析出,为胆固醇结石的形成提供基础。导致胆汁中胆固醇增加的原因主要包括:(1)肝脏分泌的胆固醇增多(2)肠道吸收胆固醇的能力增强(3)胆汁中胆汁酸及磷脂的相对含量减少,降低了胆固醇的溶解度(4)炎症介导的胆囊运动能力减弱(5)基因缺陷。ABCB4及BSEP分别负责卵磷脂及胆盐由肝细胞向胆汁的转运,基因的突变可以导致ABCB4或BSEP表达异常,引起卵磷脂或胆盐向胆汁的分泌异常,从而促进胆固醇结晶的析出及结石的形成。以上这几类转运子的表达同时受到肝脏内多种核受体(如肝脏X受体、法尼醇受体)的复杂调控,且这些核受体在肝脏脂质代谢方面亦发挥了重要作用,通过对这些核受体的进一步研究可能更好的揭示胆固醇结石发生的病理生理过程。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR γ)是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员。PPARγ通过调节相关基因的表达,在脂肪形成及调节糖脂代谢过程中发挥重要作用,并与多种疾病如肥胖症、糖尿病、代谢综合征、非酒精性脂肪肝的发生、发展密切相关,而这些疾病同时又是胆固醇结石发生的高危因素,因此我们推测PPARγ可能是这些异常代谢性疾病发生的共同枢纽。目的阐明PPARγ与胆固醇结石形成的相关性,通过动物模型的设立,研究PPARγ对小鼠胆固醇结石形成的影响以及各项生化指标的改变,分析PPAR γ对胆固醇及胆盐肝肠循环中肝脏-胆囊-小肠三个节点中关键转运酶ABCG5/ABCG8、BSEP、尼曼匹克小体C1样蛋白1(NPC1L1)表达的调节作用及机制,探讨PPARγ通过PPARγ-LXR/FXR-肝肠循环相关的下游靶基因通路影响胆固醇结石形成的分子调控机制。方法1、在人正常肝脏细胞系上构建PPAR γ过表达慢病毒系统。实时定量PCR检测细胞内 LXRα,FXR,ABCG5/ABCG8,ABCG1,CYP7A1,BSEP 转录水平表达量的变化。LXR以及FXR靶向干扰细胞系的建立,并检测ABCG5/ABCG8以及BSEP等基因的转录水平表达量的变化。2、28只C57bl小鼠被随机分为4组:普通饲料组NC组、高脂饲料(普通啮齿科饲料中加入15%脂肪(猪油)、3%胆固醇和0.5%胆盐)喂养组L组、普通饲料+盐酸吡咯列酮8mg/(kg·d)灌胃喂养组CM组、高脂饲料+盐酸吡咯列酮灌胃喂养组LM组。10周后处死小鼠观察各组成石率并且测定血生化指标总胆固醇TC,甘油三酯TG,高密度脂蛋白HDL,低密度脂蛋白LDL,谷氨酸氨基转移酶ALT,丙氨酸氨基转移酶AST。3、收集各组小鼠胆汁标本,测定胆汁磷脂、胆固醇、胆汁酸的含量,并计算胆固醇过饱和指数。胆囊标本用于做HE染色,观察胆囊本身的炎症反应。4、收集各组小鼠粪便,并检测各组小鼠粪便中胆固醇及胆汁酸含量。5、实时定量PCR检测小鼠肝脏组织内PPAR γ、LXR α、FXR、ABCG5/ABCG8、ABCG1、CYP7A1、BSEP表达量的变化,以及小肠上皮组织内 PPARγ、ABCG5/ABCG8、NPC1L1 表达量的变化。6、免疫组化检测肝脏内PPAR γ,ABCG5/ABCG8,BESP蛋白水平表达量的变化,以及小肠上皮细胞内ABCG5/ABCG8,ASBT,NPC1L1蛋白水平表达量的变化。结果1、在细胞实验中,ABCG5/ABCG8,LXR α,FXR,ABCG1,CYP7A1,以及BSEP转录水平的表达在PPARγ过表达的细胞系中显著升高。ABCG5/ABCG8,ABCG1以及CYP7A1转录水平的表达因靶向干扰LXRα的表达而降低,BSEP转录水平的表达因FXR表达的降低而降低;2、L组小鼠的胆囊炎症明显比LM组严重,NC组及CM组小鼠未发现胆囊炎症;3、肝脏HE染色显示L组小鼠肝脏存在严重的非酒精性脂肪肝变性,L组小鼠体重及肝脏重量更大,血胆固醇、甘油三酯更高,并且血HDL及血胆汁酸降低,而这些代谢指标在LM组小鼠中得到明显改善;4、L组小鼠胆汁中胆汁酸含量较LM组明显降低,而胆固醇含量以及胆固醇过饱和指数显著升高;5、与NC组比较,L组小鼠肝脏组织中PPAR γ,LXR α,FXR,ABCG5/ABCG8,ABCG1,CYP7A1,BSEP转录水平的表达明显降低,而这些基因的转录表达在LM组均得到诱导增强。6、LM组小鼠小肠组织中PPARγ,ABCG5/ABCG8,NPC1L1,ASBT等基因的表达较L组明显升高。LM组小鼠粪便中胆固醇含量较L组明显升高,而胆汁酸含量显著降低。.结论1、PPAR γ通过PPARγ-FXR-BSEP/ASBT的调控通路,增强了胆汁酸的合成代谢与肠肝循环,促使胆汁中胆汁酸含量升高;2、PPAR γ通过PPARγ-LXR α-ABCG/NPC1L1的调控通路,在肠道中抑制了胆固醇的吸收。3、PPARγ主要依靠PPARγ-LXRα-ABCG5/G8的通路调节,导致肝脏胆固醇清除能力的增强,从而抑制肝脏非酒精性脂肪肝疾病的发生发展。