黄芪甲苷（astragalosideⅣ，AS-IV），是中药材黄芪的重要有效化学成分之一。AS-IV属于环黄芪醇为苷元的皂苷类，具有多种药理作用。研究证实其保护心血管系统作用包括:增强免疫功能，抗炎，抗病毒，抗氧化，减轻缺血缺氧心肌的损伤，增强心肌收缩力，舒张血管，以及扩冠状动脉等作用。　　 AS-IV用于心血管疾病治疗，但其作用机制尚未明确，尤其对心电生理的影响尚无报道。本论文的第一部分，采用急性分离的豚鼠心室肌细胞，应用膜片钳技术观察AS-IV对心肌细胞动作电位和细胞膜各种离子通道电流的影响。第二、三部分，应用膜片钳技术和内钙测定技术分别考察AS-IV对钙信号通路的影响。第四部分，采用膜片钳技术探讨AS-IV对L型钙通道的调节机制。　　 方法：　　 一、单个豚鼠心室肌细胞的制备　　 利用Langendorff灌流装置，采用胶原酶消化豚鼠心室肌细胞，得到单个心肌细胞。　　 二、心肌细胞动作电位的检测　　 采用膜片钳技术，在电流钳模式下，检测豚鼠心室肌细胞的动作电位，观察AS-IV对细胞静息电位(resting membrane potential，RMP)，动作电位幅度(actionpotential amplitude，APA)，以及动作电位时程（action potential duration，APD）的影响。　　 三、心肌细胞膜离子通道电流的检测　　 采用膜片钳技术，在电压钳模式下，应用不同细胞内外液，并给予相应的电压刺激，诱导豚鼠心室肌细胞膜不同离子通道电流，观察AS-IV对膜钠、钾、钙通道的电流大小和电流-电压（current-voltage，I-V）曲线的影响。　　 四、豚鼠心室肌细胞内钙测定　　 应用新鲜分离得到单个豚鼠心室肌细胞，采用Fluo-3/AM钙指示剂孵育标记细胞内钙，利用荧光显微镜测定，观察AS-IV对细胞内钙的影响。　　 五、H9c2细胞内钙测定　　 在共聚焦专用小皿培养H9c2细胞，采用Fluo-3/AM钙指示剂孵育标记细胞内钙，利用激光共聚焦扫描成像系统测定，观察AS-IV对细胞内钙的影响。　　 六、单通道钙电流的检测　　 应用膜片钳单通道技术，分别采用细胞贴附模式和膜内向外模式，观察AS-IV对单通道钙电流的影响。　　 结果：　　 一、AS-IV对心肌细胞动作电位的影响　　 低、中、高三个浓度AS-IV均显著延长APD。其中，中浓度AS-IV(1×10-6M)作用最明显(APD25:111.5±18.9 in10-6 M v.s.13.1±4.1 in Control，P＜0.01;APD50:574.3±77.4 in10-6M v.s.189.2±40.3 in Control,P＜0.001;APD95:785.3±83.7 in10-6 M v.s.313.1±38.9 in Control，P＜0.001）。但是，低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞RMP和APA均无显著影响。　　 二、AS-IV对心肌细胞膜离子通道电流的影响　　 低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞的钠电流(sodium currents，INa)和I-V曲线都没有改变，提示钠通道可能不是AS-IV的作用靶点。　　 低、中、高三个浓度AS-IV对心肌细胞内向整流钾电流（inward rectifierpotassium currents，IK1）电流几乎无影响，仅在远离平衡电位(-130～110 mV)时，AS-IV使IK1电流略微增加。而对延迟外向整流钾电流(delayed outward rectifierpotassium currents，IK)，低、中、高三个浓度AS-IV有不同程度的抑制作用，并且中浓度AS-IV(1×10-6M)作用最为显著。对照组IK尾电流(IK tail)在电压为0、+10、+20、+30、+40 mV时分别为1.17±0.12，1.54±0.12，1.93±0.13，2.22±0.13，2.46±0.13 pA/pF，而1×10-6 M AS-IV组其值分别降低至0.85±0.04，1.14±0.05，1.43±0.04，1.65±0.04，1.78±0.05 pA/pF(P＜0.05，P＜0.01)。　　 低、中、高三个浓度AS-IV均使钙电流I-V曲线上移，即所有测试电压条件下的L型钙电流（L-type calcium currents，ICaL）都减小。0mV去极化刺激诱导心肌细胞ICaL，低、中、高三个浓度AS-IV分别降低ICaL至对照组的61.2％±7.2％(P＜0.05)，52.8％±6.3％(P＜0.01)，60.9％±5.8％(P＜0.05)。其中1×10-6 M AS-IV抑制作用最强。　　 三、AS-IV对心肌细胞纯钙电流的影响　　 应用膜片钳全细胞记录心肌细胞纯钙电流。低、中、高浓度AS-IV都明显抑制ICaL，而中浓度AS-IV作用最强（-2.25±0.41 pA/pF in10-6M v.s.-4.66±0.61pA/pF in Control,P＜0.01)。　　 当细胞外液中加入钙泵抑制剂毒胡萝卜素(thapsigargin，TG)时，AS-IV对纯钙电流的抑制作用呈剂量依赖性（-2.73±0.23 pA/pF in10-7 M，-2.25±0.12pA/pF in10-6 M,-1.78±0.28 pA/pF in10-5 M v.s.-4.42±0.58 pA/pF in Control)。与无TG实验相比，此时细胞内钙耗竭，结果显示高浓度AS-IV(1×10-5 M)抑制作用最强。　　 四、AS-IV对心肌细胞内钙浓度的影响　　 首先观察AS-IV急性分离的豚鼠心室肌细胞内钙变化。在细胞外液无钙状态下，1×10-6M AS-IV可引起细胞内钙浓度的显著增加，给药后荧光值与基础荧光值的比值(F/F0)由对照组的0.08±0.02增加到0.23±0.07(P＜0.05)。　　 其次，利用激光共聚焦检测H9c2细胞内钙浓度，观察低、中、高三个浓度AS-IV对细胞内钙浓度的影响。结果发现AS-IV增加内钙浓度呈剂量依赖性，高浓度1×10-5 M作用最强（1.27±0.04 in10-7 M，1.44±0.03 in10-6M，1.60±0.04in10-5 M v.s.1.04±0.01 in Control，P＜0.001）。　　 五、AS-IV对心肌细胞L型钙通道单通道电流的影响　　 应用单通道膜片钳技术，先在细胞贴附模式下，观察AS-IV对心肌细胞L型钙通道活性(NPo)的影响。结果显示低、中、高三个浓度AS-IV都使NPo显著降低(0.15±0.03 in10-7 M，0.08±0.02 in10-6 M，0.13±0.04 in10-5 M v.s.0.37±0.10 in Control，P＜0.05)，其中1×10-6M AS-IV抑制作用最为显著。　　 而在膜内向外模式下，发现AS-IV对钙通道活性的抑制作用则呈剂量依赖性。对照组的相对钙通道活性为147.9％±30.4％，低、中、高三个浓度AS-IV抑制相对钙通道活性至101.5％±18.7％，67.3％±9.2％(P＜0.01)，28.6％±5.9％(P＜0.001)。与细胞贴附模式相比，该模式记录时消除了胞浆内其它因子的影响，结果显示高浓度AS-IV(1×10-5M)抑制作用最强。　　 六、AS-IV影响钙通道的失活机制　　 应用膜片钳技术，选用1×10-6 M AS-IV，研究其影响心肌细胞膜L型钙通道的机制。实验表明，AS-IV对钙通道的激活曲线没有影响，但使钙通道的失活曲线左移。其中失活曲线的V1/2由对照组的-25.6±0.9 mV降至-31.0±2.2 mV(P＜0.05)，k值由3.6±0.2增至5.4±0.7(P＜0.05)。结果提示，AS-IV参与了钙通道电压依赖性的失活(voltage-dependent inacitvation，VDI)，使得通道在较低电压较快失活。　　 本课题基础电极内液的Ca2+螯合剂为ethylene glycol tetraacetic acid(EGTA)。这里探讨AS-IV是否参与钙依赖性的失活(Ca2+-dependent inacitvation，CDI)，用另一种更强且快速的Ca2+螯合剂1，2-bis（2-aminophenoxy）ethane-N,N，N,N-tetraacetic acid(BAPTA)取代EGTA。因为BAPTA能快速螯合胞浆内钙，使内钙浓度处于一个低水平的稳态，所以高浓度Ca2+条件下产生的CDI就消失了。我们实验证实采用含BAPTA的电极内液时，未给予AS-IV药物处理组，ICaL的失活过程减慢。其中失活的快时间常数（fast time constant，τfast）从10.4±1.1 ms延长到17.2±2.4 ms(P＜0.01);失活的慢时间常数(slow timeconstant，τ slow)从122.7±9.8 ms延长到177.0±18.1 ms(P＜0.01)。而给予AS-IV处理后，BAPTA组和EGTA组之间区别消失，快、慢时间常数都没有显著变化。结果提示，AS-IV参与了心肌细胞钙通道的CDI调节机制。　　 七、AS-IV影响钙通道的开关动力学　　 首先，在细胞贴附模式下，AS-IV减小开放时间常数(open time constant，τo)至对照组的一半以下。其中快成分τo，fast由2.15±0.35 ms降至0.82±0.14 ms(P＜0.01);慢成分τ o，slow由10.24±0.96 ms降至4.92±1.64 ms(P＜0.05)。同样给予AS-IV处理，钙通道关闭时间常数(close time constant，τc)的两成分则均显著延长。其中τc，fast延长至3.75±1.17 ms(P＜0.05)，为原来的8.2倍;τc，slow延长至25.27±4.27 ms(P＜0.05)，是对照组的2倍。　　 在膜内向外模式下，AS-IV显著减小τ o。其中τo，fast由1.63±0.23 ms降至0.89±0.10 ms(P＜0.05);τo，slow由15.70±1.76 ms降低到6.95±1.17 ms(P＜0.01)。但采用这种游离膜片消除了胞浆内其它因子的影响时，钙通道τc并未见显著延长。　　 结论：　　 1、AS-IV影响心肌细胞电生理特性，包括延长APD，抑制IK和IcaL。但对INa几乎无影响。　　 2、AS-IV对心肌细胞膜钙电流有直接抑制作用。　　 3、AS-IV增加心肌细胞内钙浓度，间接地调节细胞膜L型钙离子通道。　　 4、AS-IV对心肌细胞膜L型钙通道的影响主要通过通道失活机制发挥作用，既影响了通道的VDI，同时也有CDI的参与。　　 5、在钙通道的开关动力学方面，AS-IV缩短了单个钙通道的开放时间，并且对通道关闭时间也有一定影响。　　 本研究结果将为AS-IV在心血管疾病治疗中的应用提供重要的理论依据。