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类鼻疽是由类鼻疽伯克霍尔德菌引起的一种热带和亚热带流行的自然疫源性传染病,每年可造成8.9万人死亡,是一种被低估的传染病。类鼻疽菌可通过多种途径进入人体,临床症状多样,病程初期误诊率高,导致病人不能得到及时有效的治疗。土拉热是一种主要在北半球流行的高致病性的传染病,由于土拉热的临床症状与许多传染病相似,所以很难做出准确的早期诊断,容易造成误诊或治疗不当。鼠疫是古老的一种烈性传染病,病程较快,病死率较高并且可以人传染人,所以快速准确的诊断是降低其病死率和控制传播的关键。三种病原菌因其高致病性和广泛传播的能力皆被美国CDC列为潜在的生物恐怖战剂。本研究目的是基于LF-RPA检测技术平台,建立操作简便、快速准确的类鼻疽、土拉热和鼠疫三种病原体检测方法。第一部分研究中建立了重组聚合酶恒温扩增技术结合侧流层析试纸(LF-RPA)用于快速检测类鼻疽菌的检测方法。靶向类鼻疽菌的orf2基因设计出一组探针和引物,并优化LF-RPA检测方法的参数。可以在30分钟内肉眼观察到结果,检测灵敏度(LOD)为20 fg(约25.6拷贝)的类鼻疽菌基因组DNA。该检测方法特异性较高,不与35种非类鼻疽菌菌株发生交叉扩增。采用本研究建立的LF-RPA方法回顾性分析了中国海南省患者的临床分离菌株(N=19)。土壤和血液类鼻疽菌的模拟样本的检测灵敏度分别为2.1×103 CFU/g和4.2×103 CFU/ml。LF-RPA检测方法的灵敏度与TaqMan荧光定量PCR相当,LF-RPA检测方法较后者对血液中的抑制剂表现出更好的耐受性。第二部分研究中基于土拉菌特异性基因(tul4)设计重组聚合酶恒温扩增方法的引物及探针,优化反应时间和温度,同时评价该方法的灵敏度及特异性,并通过模拟血液样品评估此方法的实用性。结果该方法最佳反应条件是在40℃反应20min,可检测核酸最低浓度为20fg/μl,与荧光定量PCR(qPCR)方法相近,且未见与7种非土拉菌菌株发生交叉反应。土拉菌模拟样本最低检测浓度为460 CFU/ml。第三部分研究中以土拉菌和鼠疫菌的保守基因序列为检测靶标,基于LF-RPA技术建立了可同时检测并区分土拉菌和鼠疫菌的双重反应体系。该反应体系不与其他34种病原体发生交叉反应,特异性良好。该检测方法最低可检测土拉菌/鼠疫菌的gDNA均为20fg,与荧光定量PCR的结果相同,灵敏性良好。使用人工添加两种目标菌株的血液样本评估该方法的样本检测实用性,该方法检测到土拉菌和鼠疫菌最低浓度为650/750 CFU/ml。为探究双重LF-RPA检测方法现场使用的可行性,比较了水煮法和试剂盒法制备的血清样本和脾脏研磨液样本。结果显示,血清样本的最低检测限基本无影响,而脾脏样本只有在核酸量较少的时候会导致扩增抑制。综上所述,本研究初步建立了三种病原菌的LF-RPA检测方法。这些方法灵敏,特异,可快速准确地检测到目的病原菌,可适用于临床和条件匮乏的现场。为生物反恐和疫情防控工作提供了新的技术手段。