论文部分内容阅读
肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展和转移的各个阶段中都起着至关重要的作用。其中细胞外基质蛋白是肿瘤微环境的重要组成部分,在肿瘤中常常发现基质蛋白有异常表达,其有助于肿瘤的进展和转移,近年来研究显示,Lumican的表达与许多恶性肿瘤的生长和转移相关,但其在肿瘤发生发展中的确切作用还不明确。因此我们探讨了SLRP家族成员Lumican在胃腺癌发生发展中的作用,从而进一步来理解Lumican与人类肿瘤的关系。应用RT-PCR、荧光定量PCR、免疫印迹及免疫组织化学技术,在mRNA及蛋白水平检测了Lumican在胃腺癌组织中的表达情况;应用慢病毒载体系统建立了Lumican过表达和特异性干扰细胞株,利用CCK-8实验,平板克隆及裸鼠皮下成瘤实验,分析了过表达或干扰Lumican表达对胃腺癌细胞生长的影响;Transwell及Matrigel胶穿实验,分析了其对胃腺癌细胞迁移和侵袭的影响;流式细胞术检测了Lumican表达上调或下调时胃腺癌细胞失巢凋亡率的改变,及Lumican上调时胃腺癌细胞周期的改变;免疫印迹技术和细胞免疫荧光检测了smad2、samd3及samd4的表达和活化。同时我们还构建了Lumcian重组蛋白pQE30-HLumican(分子量约40kDa)原核表达载体系统及V152-HLumican(分子量约55kDa)真核表达载体系统,利用CCK-8实验,分析了两种重组蛋白对胃腺癌细胞生长的影响;通过Transwell实验,分析了两种重组蛋白对胃腺癌细胞迁移能力的影响。流式细胞术检测了V152-HLumican重组蛋白对胃腺癌细胞失巢凋亡的影响;软琼脂克隆形成实验观察了其对胃腺癌细胞非锚定生长的影响;裸鼠皮下成瘤实验观察了其对胃腺癌细胞体内生长的影响。研究结果表明:胃腺癌组织中Lumican mRNA表达水平显著高于癌旁正常粘膜组织,差异有统计学意义(P<0.05)。胃腺癌组织中Lumcian主要以其分子量为55kDa大小的糖蛋白形式存在,40kDa大小的核心蛋白(core protein)也有少量表达。免疫组化结果显示Lumican蛋白在胃腺癌组织的表达率显著高于癌旁正常粘膜(91.67%比7.5%,P<0.01),其表达水平与胃腺癌患者的性别、年龄、肿瘤发生部位、Laren分型、是否为印戒细胞癌、脉管侵犯、癌栓无明显相关,差异无统计学意义(P>0.05);而与胃腺癌的浸润深度(P<0.01)、有无淋巴结转移(P<0.01)、有无远处转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)、肿瘤大小(P<0.05)和是否为早期胃腺癌(P<0.01)密切相关。Kaplan-Meier生存统计结果显示,Lumican表达强阳性、阳性、弱阳性和阴性患者的总体生存率分别为:48.17%、53.56%、68.48%和89.48%,随着其表达增强,生存率逐渐减小,差异有统计学意义(P<0.01)。Lumican过表达能够显著增强胃腺癌细胞内核心蛋白的表达,而其糖基化蛋白增强不明显;Lumican表达受干扰后,核心蛋白表达明显下降,而其糖基化蛋白下降不明显。Lumican过表达能够抑制胃腺癌细胞在体内外的生长,抑制胃腺癌细胞迁移和侵袭,增加失巢凋亡率,同时Lumican基因过表达能够减缓细胞周期进展,一定程度引起G1期的阻滞。Lumican表达受干扰后,胃腺癌细胞生长得到促进,迁移、侵袭和抗失巢凋亡能力增强。Lumcian可能通过抑制smad4的表达,及smad2和smad3的活化来调控胃腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和抗失巢凋亡。pQE3O-HLumican重组蛋白可抑制胃腺癌细胞的增殖及迁移。V152-HLumican重组蛋白可促进胃腺癌细胞的增殖及迁移,增强胃腺癌细胞的抗失巢凋亡能力。我们的研究结果发现Lumican核心蛋白及糖基化蛋白均在胃腺癌组织中高表达,Lumcian核心蛋白具有抑制胃腺癌细胞生长、迁移和侵袭的作用,而Lumican糖基化形式的蛋白可促进胃腺癌的增殖、迁移和侵袭的作用。Lumican及其糖基化修饰在胃腺癌发生发展中发挥着重要作用。