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在农林、园艺行业中,不定根形成是扦插快速繁育优良品种的关键环节,而根原基的起始和诱导又是不定根形成的关键环节。常规桑树硬枝扦插不定根的形成以愈伤组织生根型为主,经吲哚-3-丁酸（indole-3-butyric acid,IBA）处理后,在适宜培养条件下转变为以生根效率高的皮部生根型为主,但是IBA诱导的生根形式变化的调控尚不清楚。为了探究桑树硬枝扦插这两种生根类型的差异以及IBA对插穗所起到的作用,本试验采用生化技术、转录组测序技术和小RNA测序技术对桑品种“育711”两种生根类型的三个发育时期（stage1-诱导期、stage2-膨大期、stage3-生根期）进行了比较研究,并深入分析了皮部生根型插穗不定根形成初期（扦插后54h）的生理和转录组变化。两种生根类型在三个发育时期的主要试验结果和结论如下:1、两种生根类型插穗中可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉含量降低,皮部生根型淀粉含量始终低于对照,说明不定根形成涉及强烈的物质和能量转化,而IBA促进了皮部生根型插穗的淀粉代谢。与愈伤组织生根型相比,皮部生根型的生长素（indole-3-acetic acid,IAA）含量表现出更明显的波动变化,玉米素（zeatin,ZA）含量高于对照,说明IBA可能促进了皮部生根型插穗中IAA和ZA的合成。两种生根类型插穗中的过氧化物酶（peroxidase,POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）和吲哚乙酸氧化酶（indoleacetic acid oxidase,IAAO）等促生根酶活性在整个发育时期都呈现逐渐上升的趋势,且皮部生根型始终高于愈伤组织生根型。相反,两种生根类型中的H2O2和可溶性酚等物质的含量呈现逐渐下降的趋势,而皮部生根型始终低于愈伤组织生根型。这一系列结果表明,IBA提高了皮部生根型插穗中促生根酶的活性,降低了活性氧等毒害物质的产生,使得皮部生根型比愈伤组织生根型更易生根。2、皮部生根型插穗相对于愈伤组织生根型在三个发育时期均差异表达的基因有264个,这些基因被聚类到5个具有不同表达模式的簇中。相比于愈伤组织生根型,皮部生根型中编码POD和PPO的基因在stage3时期显著上调,这与stage3时期POD和PPO活性显著高于对照一致,这一结果表明POD和PPO是调控插穗不定根形成的关键因子。皮部生根型中的植物-病原体互作、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和植物激素信号转导通路中的基因整体上被激活,而昼夜节律通路整体上被抑制,说明IBA激活了皮部生根型插穗的应激反应,抑制了对光的响应。另外,这几条通路通过共用BAK1（brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1）、FLS2（flagellin-sensing 2）等蛋白来相互影响,共同调控不定根形成。3、小RNA测序结果表明,皮部生根型插穗在三个发育时期均相对于愈伤组织生根型差异表达的miRNA有6个,即mi R319a-3p、mi R162-3p、mi R396b、mi R164a＿4、mi R170-5p和mi R171b-3p＿3,这6个miRNA的靶基因被注释到多条KEGG通路中。Small RNA-Seq与RNA-Seq的联合分析结果发现,皮部生根型相比于愈伤组织生根型在三个发育时期共有三个差异表达的负相关miRNA·m RNA靶对,即mi R395a＿5·RPM1（disease resistance protein RPM1）、mi R396b·PXL1（phloem intercalated with xylem-like1）、mi R172c＿2·fls H（filamentation-temperature-sensitive protein H）,调控了不定根形成过程中的细胞分裂、应激反应等生理活动。另外,不管是皮部生根型还是愈伤组织生根型,相邻发育时期之间的比较组中都存在较多的差异表达miRNA·m RNA靶对,说明在不同的发育时期,由不同数量和种类的靶对参与调节。可见,miRNA·m RNA靶对在桑树硬枝扦插不定根形成过程的调控的复杂性。皮部生根型插穗不定根形成初期的主要试验结果和结论如下:4、糖代谢通路中TCA循环的基因表达水平增加,以及蔗糖转化为其它形式可溶性糖的作用受到抑制,使得插穗在不定根形成初期可溶性糖含量降低。呼吸作用产生的高水平能量和底物提高了蛋白质的合成能力,且蛋白质和氨基酸的降解途径受到抑制,所以最终使得插穗内可溶性蛋白含量升高。5、生长素转运蛋白表达量的上升,触发了皮部生根型插穗内生长素的积累,使得IAA在扦插后6h出现峰值,在随后的48h内,IAA被逐渐消耗,以促进不定根形成。ZA含量也是迅速诱导后下降至稳态水平,参与细胞分裂素降解、转运和信号转导的基因表现出时相专一表达模式。乙烯和茉莉酸可能在桑树硬枝扦插不定根形成的诱导时期发挥积极作用,而不是在起始时期发挥作用。POD和CAT活性持续增加,IAAO从0h开始就一直维持在较高水平,PPO活性随可溶性酚和IAA水平的变化而波动。6、皮部生根型插穗在不定根形成初期的转录组比较分析鉴定出了一系列的保守基因,这些基因在-6h（对照组）、0h和54h AP（hours after planting,h AP）受到不同程度的调控,且被聚类到五个具有不同生物功能的簇中。相当多的保守基因被注释到糖代谢、MAPK和植物激素信号通路中。基因共表达网络揭示了三个共表达模块,即应激反应、淀粉代谢和昼夜节律。综上所述,IBA对桑树硬枝扦插不定根形成具有积极的作用;能量代谢、植物激素信号转导、植物-病原体互作、应激反应和昼夜节律等通路对桑树硬枝扦插不定根形成起重要调控作用;mi R395a＿5·RPM1、mi R396b·PXL1、mi R172c＿2·fls H可能参与调控IBA诱导下的桑树硬枝扦插不定根形成。