原发性膀胱输尿管反流(VUR)是儿童常见的先天性尿路畸形,反流性肾病(Reflux nephropathy, RN)可引起肾疤痕、肾萎缩和肾功能的减退。北美儿童肾移植协作组1996年报道儿童肾移植中有5.6%的原发病为VUR,而在儿童高血压患者中20%的病因可为VUR继发返流性肾病而引起。有研究显示VUR的早期发现与积极治疗可有效降低返流性肾病的发生率,提示VUR的及早诊治十分重要。各国学者对VUR发病机制、诊断、治疗等各方面进行了大量的研究,发现有相当一部分该病患者的反流等级可以随着年龄的增长而出现自我缓解甚至消失,因此明确哪些临床因素会影响VUR患者的早期预后就显得尤为重要,目前国内尚无相关报道。国内外学者对于原发性膀胱输尿管反流人群的基因组学进行了大量的研究,然而目前未有一致性结论。近年来,有学者认为原发性膀胱输尿管反流是泌尿系发育延迟的结果。这一假说的提出从另一个角度推测了VUR的发病机制,目前相关的动物模型研究支持这一假说。本研究第一部分通过回顾性分析2000年1月至2009年12月在我院诊断并随访1-2年的小儿原发性膀胱输尿管反流患者的临床资料,探讨其早期预后和相关临床因素的关系,希望加强对该病的认识与重视,从而建立符合我国国情的规范化诊疗体系。本研究第二部分通过免疫组化的方法研究Pax2这一在发育期表达,生后痕量表达的蛋白在原发性膀胱输尿管反流患儿输尿管上皮中的表达情况,进一步研究了VUR患者输尿管上皮的凋亡状况以及和UPⅢ蛋白的表达,从而初步探讨原发性膀胱输尿管反流可能的发病机制。第一部分原发性膀胱输尿管反流患者早期预后与相关临床因素关系的分析目的原发性膀胱输尿管反流是儿童最常见的先天性泌尿系畸形,该病可引起反流性肾病,继而引起肾疤痕,严重者可以引起肾功能衰竭。该病有随着患儿年龄增长继而出现自我缓解和消失的趋势,本部分研究回顾性地分析了原发性膀胱尿管反流患者早期预后和相关临床因素的关系,明确影响其早期预后的临床因素。对象和方法对象：纳入标准为①2000年1月至2009年12月期间,在复旦大学附属儿科医院经过X线排尿期膀胱尿路造影(MCU)诊断为原发性膀胱输尿管反流并随访1-2年的VUR患者②随访期间至少重复一次MCU检查(与首次MCU检查间隔至少1年)③同时未经手术治疗、只接受维持量抗生素预防感染治疗的VUR患者。反流等级的判断依据MCU检查结果,肾损害的检出依据放射性核素肾静态扫描(DMSA)及eGFR结果。方法：分析的临床资料包括性别、年龄、是否为单双侧反流、首诊时反流等级、首诊时DMSA结果、一年后重复MCU的反流等级结果、随访期间的尿常规,尿培养。使用SPSS19.0统计软件建立数据库并进行数据分析：t检验、卡方检验和秩和检验对各组因素进行均衡性检验；应用Logistic回归对膀胱输尿管反流患者的反流等级变化的影响因素进行分析；Wilcoxon秩和检验比较2组间的差别,Kruskal-Wallis秩和检验比较多组间的差别。结果(1)共纳入73位患者,初诊时患者的一般状况包括：①73位患者中,平均年龄2.23±2.22岁(0.2-9.0岁)其中<2岁患者占65.8%,2次MCU检查间平均随访时间为1.29±0.393年(1-2年),所有患者在随访期间未行手术治疗,只接受维持量的抗生素预防感染治疗。②73位患者中伴肾损害有27人(37.0%),无肾损害有46人(63.0%),DMSA结果提示有肾损害的反流患者中有2人eGFR值<90ml/min,都为CKD Ⅱ期患者,其余71位患者的eGFR值均)90ml/min。③膀胱输尿管反流程度：在73位患者中,双侧反流25人,单侧反流48人,Ⅰ级反流8人(10.9%),Ⅱ级反流6人(8.2%),Ⅲ级反流39人(53.4%),Ⅳ级反流19人(26.0%),Ⅴ级反流1人(1.5%)。④高度反流患者中伴肾损害有5人(25.0%),中度反流中伴肾损害有16人(41.0%),低度反流患者中伴肾损害有6人(42.9%),肾损害在轻中重三组患者间分布无明显统计学差异(P=0.425)(2)患者早期预后情况：所有患者都在明确诊断1年-2年内重复第二次MCU及DMSA检查,41位(56.16%)患者其反流等级在早期就得到得到缓解,其中27位(36.9%)患者反流等级早期就得到完全缓解；19位(26.03%)患者反流等级未发生明显变化,13位(17.81%)患者反流等级发生加重。轻度反流患者有6人(42.85%)反流等级发生缓解,中度反流患者有19人(48.72%)反流等级发生缓解,高度反流患者中有16人(80.00%)反流等级发生缓解。(3) Logistic回归分析结果：①确定与患者早期反流缓解的相关因素包括：反流等级OR=2.462(95%CI:1.015-5.973)、肾脏损害OR=0.100(95%CI:0.029-0.347)②确定与患者早期反流完全缓解的相关因素包括：肾脏损害OR=0.192(95%　CI:0.056-0.654)③确定与患者早期反流加重的相关因素包括：反流等级OR=0.077(95%　CI:0.013-0.457)、肾脏损害OR=40.70(95%　CI:4.032-410.824)。(4)对各组患者(轻、中、重)伴与不伴肾损害的早期反流缓解率进行两独立样本的Wilcoxon秩和检验,结果表明：P=0.025伴与不伴肾损害中度等级反流组患者的早期反流缓解率有明显差异(P<0.001)。(5)对伴与不伴有肾损害的各组患者(轻、中、重)的反流缓解率进行Kruskal-Wallis秩和检验,结果表明：不伴有肾损害的各级患者(轻、中、重)早期反流缓解率无明显差别(P=0.978),伴有肾损害的各级患者(轻、中、重)的反流缓解率有明显差别(P=0.018)。讨论(1)肾损害是影响膀胱输尿管反流患者早期反流缓解的重要因素,同时也是导致反流加重的重要相关因素。(2)高等级反流患者比中等级和低等级患者更容易出现反流等级的早期缓解,不伴有肾损害的各级反流患者(轻、中、重)早期反流缓解率无明显差别。(3)无肾损害的轻度和中度反流患者其早期缓解率较高,但如果一旦发生肾损害,低等级和中等级反流患者的反流等级早期就有高风险加重的危险,因此决定低等级和中等级反流患者的反流等级早期预后主要取决于患者有无肾损害,所以必须加强对伴有肾损害的低等级和中等级反流患者的随访,同时必须根据其临床特点及时予以个体化治疗,必要时可考虑手术。(4)无肾损害的高等级反流患者可以考虑门诊随访1-2年后再根据其最新MCU结果决定下一步治疗方案,但伴有肾损害的高等级反流患者仍是手术的指征。(5)本研究所纳入的伴肾损害高等级反流患者数较少,可能会对结果产生偏移,我们期待有更大样本量的伴肾损害反流患者的长期随访研究。第二部分Pax2蛋白与原发性膀胱输尿管反流的相关性研究目的观察Pax2蛋白在原发性膀胱输尿管反流患者输尿管组织的表达状况,初步探讨Pax2蛋白再表达与原发性膀胱输尿管反流可能的发病机制。材料和方法(1)材料：病例组26例,为行输尿管移植术的VUR患儿,取材为术中切下的异常输尿管。对照组3例分别为后尿道瓣膜患儿,神经源性膀胱患儿,膀胱肿瘤患儿术中切下的输尿管。(2)方法：输尿管组织经常规的石蜡包埋后经免疫组化方法(Envision二步法)及TUNEL法分析输尿管上皮细胞Pax2蛋白和UPⅢ蛋白表达情况以及输尿管上皮细胞的凋亡状态,所有图像经Motic彩色图像分析软件进行处理与分析。结果(1)根据免疫组化结果可见病例组患者的输尿管上皮可见大量表达Pax2蛋白阳性,对照组患者输尿管上皮未见明显Pax2蛋白表达；(2) TUNEL结果可见病例组患者的输尿管上皮存在大量细胞凋亡,对照组患者未见明显凋亡,图象经处理统计分析后发现病例组与对照组在阳性面积百分比上有显著差别(P<0.001)；(3)膀胱输尿管反流患者输尿管上皮细胞Pax2的表达量和TUNEL结果呈正相关(P<0.001,r=0.931)；(4)病例组输尿管处于凋亡状态的上皮细胞表达UPⅢ蛋白不连续,部分上皮UPⅢ蛋白表达缺失。对照组输尿管未处于凋亡状态的上皮细胞表达UPⅢ蛋白连续、线性,未见明显UPⅢ蛋白表达缺失。讨论(1)膀胱输尿管反流患者输尿管上皮细胞仍在大量表达Pax2蛋白,这可能和其上皮处于分化凋亡状态有关。(2)处于分化凋亡状态的输尿管上皮细胞可能无法正常表达UPⅢ蛋白。