爱波斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是γ疱疹病毒家族成员,属DNA病毒,人类是它的宿主,并且一旦感染终身携带。在全世界的成年人中EBV感染率很高,EBV感染与传染性单核细胞增多症、Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、免疫缺陷病人的B细胞淋巴瘤和胃癌等多种良性和恶性疾病有关,EBV感染外周血B淋巴细胞可以导致其永生化和不断增殖。EBV感染分为潜伏感染和溶细胞感染两种状态,潜伏感染状态是以表达一系列EBV潜伏感染蛋白为特征,其中包括6个核蛋白(EBNA1、 EBNA2、 EBNA3A,3B,3C和EBNA-LP)、3个潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2A和B)、2个小核RNA(EBER1和2),以及Bam HI-A转录区等共12个EBV基因编码蛋白。EBV与多种人类上皮性肿瘤有关,其中与鼻咽癌的关系最密切,鼻咽癌中EBV阳性率达到90%～100%。EBV的潜伏膜蛋白基因1(latent membrane protein1,LMP1)是最重要的病毒基因产物之一,它不仅在潜伏感染状态时表达,而且也在EBV溶细胞循环状态中大量表达。已知LMP1是唯一被证实的EB病毒基因编码的癌基因,它是由一个短的氨基末端的细胞内区、六个疏水的跨膜区和一个细胞内梭基末端构成的完整的膜蛋白。研究显示,LMP1在结构上与肿瘤坏死因子受体家族的CD40类似,具有激活物受体特征,LMP1可以和肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)和肿瘤坏死因子受体相关死亡区域(TRAD)蛋白结合；LMP1梭基末端具有生长转化功能,在EBV诱导的B淋巴细胞转化过程中起关键作用。从鼻咽癌组织中获得的EBV LMP1基因(N-LMP1)与标准的B95-8细胞来源的LMP1基因(B-LMP1)序列存在一定的差异。与标准株LMP1基因比较,N-LMP1的致瘤性更强,它的主要特征是在其3’端存在一段30bp核苷酸的缺失及33bp重复序列的增多。EBV感染B淋巴细胞的途径已十分清楚,B细胞表面存在EB病毒受体人补体受体2(complement component receptor2，CR2),CR2原为补体C3d的受体,因EB病毒主要壳膜糖蛋白gp350/220的分子结构与C3d高度相似,故可经过该受体进入细胞。然而,EB病毒如何进入上皮细胞,其机制至今未明,可能通过以下途径：(1)通过与上皮细胞表面的CR2受体结合或作为免疫复合物的一部分与上皮细胞的免疫球蛋白受体相结合而进入被感染细胞；(2)通过产病毒细胞与上皮细胞间的直接接触或与粘膜细胞融合而感染上皮细胞；(3)在辅助因子／辅受体的帮助下感染细胞,或在辅病毒的帮助下转变为能感染上皮细胞的假型；目前受体学说支持率最高,多数学者认为EBV是通过上皮细胞表面的受体而得以进入细胞的。虽然有关上皮细胞是否表达CR2至今仍有争论,但已有多位研究者尝试用不同的方法将CR2基因导入多种细胞,所有研究均证实,在提高细胞内CR2表达水平后,EBV可成功感染原不能感染的细胞,或能明显提高细胞对EBV的感染率。EBV的ED-L2是EBV自身的启动子,ED-L2启动子是早期细胞裂解启动子,位于BNLF2(LMP2)转录起始位点开放读码框的上游,紧邻BNLF1(LMPl)开放读码框的下游,位于EBV-BNLF-2A短开放读码框5’端和LMP1基因开放读码框(LMP1)3’非翻译区内,是具有嗜角质细胞特异性的启动子。当含有LMP1片段的EBV基因编码在ED-L2启动子的控制下时,该基因将被转录并表达于舌、咽和食道等鳞状上皮。在ED-L2启动子有一个CACACCC盒样cis-调控组件,锌指蛋白通过与该区域的特异性相互作用而调节ED-L2启动子活性。佛波脂就可通过一个锌指蛋白依赖因子与CACACCC特异性相互作用而增强ED-L2启动子活性。猪在解剖、组织、生理和营养代谢、血液生化指标、疾病发生过程等方面与人类极为相近,猪作为实验动物的一个重要应用是建立人类疾病模型。近年来,手工克隆(handmade cloning,HMC)技术的发展大大推进了猪作为人类疾病动物模型的研究。手工克隆是一项不需要显微操作,操作简单省时的核移植方法,该方法最早被应用于牛的体细胞核移植,并且得到后代。HMC技术路线主要包括卵母细胞去透明带,徒手切割半卵去核,双半卵融合、激活,以及支持无透明带卵／胚胎的培养体系；与常规核移植方法相比,HMC技术最大的特点是对实验设备的要求相对而言不是太高,不需要显微操作仪,而且对技术人员的要求也降低许多。运用该技术,猪作为人类疾病动物模型已应用在糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病及眼科疾病等方面,但在有关鼻咽癌方面尚未见报道。我们拟采用鼻咽癌来源的LMP1(N-LMP1)和CR2,分别利用泛表达启动子CMV和嗜鳞状上皮启动子ED-L2与之构建转基因猪模型,以期实现N-LMP1和CR2在猪鼻咽上皮高水平表达,从而诱发猪患上与EBV感染相关的鼻咽癌。本文进行了如下研究：(一)转基因猪胚胎成纤维细胞的构建与鉴定PCR法分别扩增出ED-L2、N-LMP1、CR2三个基因片段,以pNl-CMV为基础载体,用Sma Ⅰ和Age Ⅰ双酶切CR2基因后回收产物,与同样酶切处理的pNl-CMV载体进行连接,构建PN1-CMV-CR2重组质粒；用Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ双酶切N-LMP1基因后回收产物,与同样酶切处理的PN1-CMV-CR2载体进行连接,转化E. coli DH5a感受态,卡那青霉素筛选培养,PCR鉴定阳性克隆后扩繁提取质粒,获得表达载体PN1-CMV-N-LMP1-CR2,对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定,结果符合预期；用Ase Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切ED-L2启动子后回收产物,与同样酶切处理的PN1-CMV-N-LMP1-CR2载体进行连接,转化E. coli DH5a感受态,卡那青霉素筛选培养,PCR鉴定阳性克隆后扩繁提取质粒,获得表达载体PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2,对重组质粒进行酶切和DNA测序鉴定,结果符合预期；利用脂质体法将两种表达载体pNl-CMV-N-LMP1-CR2和PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2分别转染猪胚胎成纤维细胞系,经过G418筛选,提取细胞基因组DNA,鉴定基因插入阳性的细胞扩繁,送手工克隆。(二)转基因猪的构建与鉴定卵母细胞经过切卵、拣卵后,放入含有体外成熟(IVM)培养液的4孔板内,置于38.5℃,5%CO2培养箱培养。41-42h后,用透明质酸酶将卵丘细胞和成熟的卵母细胞分离,用口吸管吸出卵母细胞,去除透明带,切割能够观察到极体的卵母细胞,切除带有极体部分的大约30%,每一个胞质都放到含有融合液的融合槽中,调整参数至l00vDC、9us、2-4vAC,与单个体细胞一一配对融合。一个小时后,体细胞融合胞质与用于二次融合的胞质一一配对融合,此时调整参数至43vDC、80us、2-4vAC。此后将两两融合后的重构胚转移至IVC盘的加有化学激活剂的孔内,再将IVC盘放入38.5℃,5%CO2,5%02,90%N2三气培养箱内培养。化学激活4-5h后,洗去激活剂,将重构胚依个放入微穴培养孔中培养,第六天将发育好的囊胚送去移植到受体母猪的子宫内,按常规饲养至分娩。共出生16头巴马小型猪,其中有8头在出生两周内就死亡了,取全部猪的基因组DNA鉴定,已死亡的8头小猪中有6头阳性,阳性率为75%,其余8头活猪无一阳性,取了5头死猪的舌、喉咽、会厌等部位HE染色,没有观察到组织异型增生。本次实验我们共构建了PN1-CMV-N-LMP1-CR2和PN1-ED-L2-N-LMP1-CR2两个真核表达载体,其中去掉了N-LMP1的终止密码子TAA,在N-LMP1和CR2之间增添了一段E2A序列GTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCC(在pGH-N-LMP1质粒合成时已包含),使N-LMPl和CR2之间含有环-螺旋结构,两个目的基因翻译后不会形成融合蛋白。载体经过酶切鉴定和测序验证都与预期相符和。将两个载体分别转染了猪胚胎成纤维细胞,筛选出整合了N-LMP1和CR2双基因的细胞系,利用筛选出的细胞系作为手工克隆的供体细胞,与卵母细胞融合,通过电激活和化学激活后产生的重构胚移植到受体母猪的子宫内,受孕3个月后共生产出16头小猪,有6头是转基因阳性,但较为遗憾的是,这6头阳性克隆猪均在2周内死亡,没来得及检测RNA和蛋白质水平是否表达,HE染色猪舌、喉咽、会厌等部位均没有发现组织形态有异常,究其原因,可能有以下3点：1、目的基因没有表达；2、目的基因表达了但由于猪存活时间短,没能发现异型增生；3、取组织的部位不合适,导致没能取到异型增生的组织。另一方面,猪死亡原因可能与基因重组、遗传外重新编程、体细胞核移植本身、小型猪特殊的遗传背景、基地饲养水平等有关,具体原因仍需进一步确定。本次实验虽然阳性克隆猪没有存活,但我们已经将有关鼻咽癌的基因运用到猪模型上,做了一次有意义的尝试,同时也为以后建立猪鼻咽癌模型提供了一些有价值的材料和参考资料。