小麦是世界上重要的粮食作物之一,期生长和产量受到干旱、盐碱、极端温度等非生物胁迫的严重影响,因此提高小麦的耐逆性是提高其产量的一个重要途径。非生物胁迫抗性是由多基因控制的复杂性状,涉及到胁迫应答、离子转运、次生代谢以及能量代谢等诸多方面,因而细胞工程技术是培育耐逆新品种的一种理想的策略。本实验室利用不对称体细胞杂交创制渐渗系新技术,获得了普通小麦济南177(JN177)(Triticum aestivum L.2n=42)与耐盐小麦近缘属长穗偃麦草(Ae)(Thinopyrum ponticum 2n=70)的小麦渐渗系耐盐新品种山融3号(SR3)。前期工作发现,SR3基因组渐渗了少量长穗偃麦草遗传物质,并且发生了高频率的遗传学和表观遗传学变异,因而SR3是研究遗传变异、克隆耐逆基因和解析耐逆机制的理想材料。非生物胁迫下植物细胞产生大量活性氧物质(Reactive Oxygen Species,ROS),能引起严重的氧化伤害。植物在长期进化中形成了复杂而高效的ROS应答和清除机制,能合成多种酶促和非酶促ROS清除剂,后者包括黄酮类化合物。黄酮类化合物是一类低分子量次生代谢物,具有重要的生物学功能,参与UV保护和胁迫应答等多种生物学过程。前期组学研究发现,抗氧化是SR3的抗逆性的重要基础,而且一系列类黄酮合成相关酶基因的表达在SR3和JN177间存在差异,暗示类黄酮可能与SR3的抗逆性相关。据此,本实验分析了SR3和JN177中类黄酮含量和合成相关基因表达谱,克隆了小麦黄酮醇和花青素合成分支途径关键酶黄酮醇合成酶基因TaFLS1和花青素合成酶基因TaANS1,测定了其编码蛋白的体外和体内活性,研究了其过表达对拟南芥发育和抗逆能力的影响,以确定类黄酮和SR3抗逆性的关系、探讨类黄酮在发育和抗逆中的作用机制。主要研究内容和结果包括：1.小麦黄酮类化合物含量测定及合成相关基因表达谱分析为了初步验证黄酮类物质与SR3抗逆性的关系,首先测定了SR3和JN177三叶期幼苗中黄酮类化合物的含量。对照和200 mM NaCl胁迫下,SR3三叶期幼苗根中的总黄酮含量均高于JN177,而花色素含量均低于JN177；叶中,SR3的总黄酮和花色素含量均低于JN177,结果显示,SR3和JN177总黄酮及花青素的合成能力存在差异性,表明黄酮类化合物可能与SR3的抗逆能力相关,而且暗小不同类型类黄酮在抗逆中的作用右能不同。其次,利用RT-PCR和Real-time PCR方法,进一步分析了不同胁迫下SR3和JN177中类黄酮合成途径相关基因的表达模式。结果发现,黄酮醉合成分支相关合成酶基因在胁迫下被诱导表达,而花青素分支途径相关酶基因则受到抑制。某些基因的表达模式在SR3和JN177间存在差异,其中盐胁迫下黄酮醇合成酶基因TaFLSl在SR3中持续上调表达,在JN177中仅在短时间内上调表达并随即恢复到原来水平,而花青素分支起始酶TaDFR和下游关键酶基因TaANSl的表达模式与TaFLSl相反。这些结果显示,盐胁迫影响了类黄酮合成途径,SR3和JN177间总黄酮及花青索的合成能力存在差异,表明黄酮类化合物与SR3的抗逆能力相关。2. TaFLSl的功能研究及其在逆境应答中的作用机制根据黄酮醇和花青素合成途径的胁迫应答特征及其在SR3和JN177间的差异,本实验从SR3和亲本JN177中克隆了一个小麦黄酮醇合成酶基因TaFLSl。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,对照条件下TaFLSl在SR3中的表达量高于JN177,200mM NaCl、18% PEG6000、100μM ABA和10 mM H2O2胁迫条件下SR3和JN177中的响应时间不同,而且SR3的表达量更高。研究发现,这种差异与SR3中TaFLSl启动子区域甲基化水平较低相关。体外实验表明,原核表达的TaFLSl具有体外催化活性,能将二氢黄酮醇(二氢槲皮素和二氢山奈酚)转化为黄酮醇(槲皮素和山奈酚)。TaFLSl拟南芥过表达株系(OE)幼苗中积累了更多的黄酮醇,而内源AtFLSl表达量降低,表明黄酮醇的积累源于TaFLSl的过量表达,即TaFLSl具有体内催化功能。同时,OE株系幼苗中花色素含量明显降低,子叶叶柄、下胚轴以及种皮颜色变浅,花青素分支途径相关酶基因表达量下降,说明花青素分支途径被抑制,类黄酮合成由花青素转向黄酮醇。OE株系在含有NaCl的培养基中的生长状态明显优于空载体对照(VC)株系；在土壤中控水14天后,VC株系明显萎蔫,而OE株系叶片仍呈绿色,复水3天后,VC株系死亡,而OE株系恢复生长。OE株系离体叶片的失水率明显低于VC株系,而且ABA和旱胁迫下气孔开度更小。OE株系中超氧化物岐化化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等ROS清除酶活性显著提高，其编码基因表达水平也显著上调,而ROS和丙二醛(MDA)含量显著下降,在H2O2胁迫下的植株大小及根长明显增加。这些结果表明,TaFLSl过表达通过增强抗氧化活性胁迫条件下促进气孔关闭保留水分来提高植物的耐盐抗旱能力。Real-time PCR分析显示,OE株系中ABA合成和信号转导途径关键基因ABA1、AA03、ABIl和ABI2以及ABA依赖的胁迫应答途径关键基因RD22和¨RD29B等的表达均明显上调,表明TaFLSl可通过增强ABA合成以及ABA依赖的胁迫应答途径增强植物的耐盐、抗旱能力。与ABA和旱胁迫下不同,正常条件下OE株系的气孔开度明显大于VC株系,表明TaFLSl在气孔运动中发挥双重调控作用,促进气孔打开可能是由于黄酮醉积累后磷酸肌醇3激酶(PI3K)活性降低,促使ROS合成能力下降、ROS清除酶活性增强从而引起ROS水平降低以及生长素运输受阻引起的。3. TaANSl的功能研究为了系统分析黄酮醇和花青素分支途径与SR3抗逆能力的关系,本实验从SR3中克隆了一个小麦花青素合成酶基因TaANSl。Real-time PCR分析显示,盐、旱、H2O2和激素ABA胁迫下,TaANSl在SR3中均呈现持续下调的表达模式,说明TaANSl也参与植物对非生物胁迫应答。与TaFLSl不同,TaANSl OE株系的抗旱能力明显低于VC株系。Real-timePCR分析显示,TaANSl OE株系中ABA合成途径关键基因AA03和NCED3表达明显增加,而ABA信号转导以及ABA依赖的胁迫应答途径关键基因ABF3、RAB18、RD22和RD29B表达则明显降低,表明TaANSl过表达可能是通过抑制ABA依赖的胁迫应答途径降低植株的抗旱能力。综上,本实验从小麦中克隆了黄酮醇和花青素两个合成分支途径的关键酶基因TaFLSl和TaANSl,其过表达能改变分支途径的动态平衡,分别提高体内黄酮醇和花青素的含量;它们通过对ABA信号通路的正负调控在植物抗逆中·的发挥相反作用；黄酮醇在气孔运动中发挥双重作用,正常条件下促进气孔打开,胁迫条件下促进气孔关闭,而促进气孔打开可通过抑制ROS合成、增强ROS消除、抑制生长素运输实现。