免提取探针法一步法逆转录-实时荧光定量聚合酶链式反应（Extraction-Free Probe One-Step Reverse Transcriptase-Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,EFPO RT-qPCR）作为一种省时省力的核酸检测技术,在食品快速检测领域具有广泛的应用前景。目前,EFPO RT-qPCR体系存在检测灵敏度不足和特异性低等问题。逆转录酶为EFPO RT-qPCR的核心组分之一,但野生型逆转录酶（W-RT）热稳定性差,抑制剂耐受能力弱。因此改造出具有高抑制剂耐受性的逆转录酶对推动EFPO RT-qPCR技术的进步具有重要意义。本文应用基因工程技术改造野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（W-MMLV RT）,研究了突变型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（CMMLV RT）的酶学性质,基于CMMLV RT建立了血液EFPO RT-qPCR检测体系。主要研究内容及结论如下:（1）CMMLV RT的重组表达。设计并合成了CMMLV RT基因,构建了p MAL-c2x重组表达载体,实现了CMMLV RT在大肠杆菌BL21的重组表达。优化CMMLV RT的诱导表达条件为:诱导温度25℃、诱导时间12 h、诱导剂IPTG浓度0.1 m M。采用镍离子亲和层析技术制备电泳纯CMMLV RT储存液,其蛋白浓度为0.247 mg/m L,酶活性浓度为1.470×10~3 U/μL。（2）CMMLV RT酶学性质研究。以两步法RT-PCR扩增结果为依据,优化CMMLV RT缓冲液组成为:50 mmol/L Tris-HCl、3 mmol/L Mg Cl2、75 mmol/L KCl、10mmol/L DTT,p H 8.3。CMMLV RT的催化逆转录的反应最适温度为55℃,且在40-75℃温度范围内能够稳定发挥活性。CMMLV RT的热稳定性和延伸能力比W-MMLV RT强,在50℃孵育2 h时仍具有79%活性。（3）CMMLV RT耐抑制剂性能研究。应用两步法RT-qPCR中Ct值（荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数）建立了不同抑制剂对逆转录酶活性抑制率的计算方法。CMMLV RT耐受PCR抑制剂的能力较强,当逆转录体系中存在3.0 mmol/L EDTA、0.525 U/m L肝素钠、0.75μg/μL黄芪多糖、350 mmol/L尿素或15%甲酰胺等抑制剂时,CMMLV RT可保留50%以上的催化活性。（4）CMMLV RT用于EFPO RT-qPCR的相关研究。优化了用于检测血液标本中新型冠状病毒的EFPO RT-qPCR反应体系,并确定了最CMMLV RT适添加量、最适探针浓度、最适逆转录温度等检测参数。在2%-8%（v/v）血液添加量下,所建立的检测方法的扩增效率均接近100%,检测方法重复性好,最低检测限与常用的两步法RT-qPCR方法的最低检测限处于同一数量级。