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鼻咽癌是一种与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染密切相关的鼻咽上皮恶性肿瘤,然而EBV促进鼻咽癌发生发展的确切机制还没有完全阐明。最近有证据指出一类由EBV编码的微小RNA(microRNA, miRNA)分子可能参与了EBV介导的鼻咽上皮恶性转化,从而影响鼻咽癌的发生发展。目前已发现EBV可编码25个miRNAs前体,加工成44个成熟的miRNAs,且EBV编码的miRNAs在EBV基因组上成簇分布,可以分为BART和BHRF1两组。但鼻咽癌中对于EBV编码miRNAs的研究还不是很透彻,44个成熟的EBV miRNAs中大部分还没有功能研究的报道。为了确定EBV编码的miRNA如何调控宿主基因的表达,了解EBV miRNA在鼻咽上皮恶性转化中潜在的作用机制,本课题构建了鼻咽癌和正常对照组织中EBV编码的全部44个成熟miRNAs的表达谱；对这些EBV miRNAs和它们潜在的宿主靶基因进行分析,构建了EBV miRNA和它们宿主靶基因之间的调控网络；最后,从中挑选了EBV miRNAs BART10及其靶基因BTRC进行初步验证。1、构建EBV miRNAs的表达谱通过Real-time PCR技术检测了鼻咽癌、正常对照组织及相关细胞系中EBV编码的miRNAs表达水平,同时检测了两个EBV编码的蛋白表达基因LMP1和EBNA1以作为参照。所检测的样品包括16例鼻咽癌活检组织(其中临床TNM分期第Ⅱ期5例,Ⅲ期5例,Ⅳ期6例)、5例正常对照组织(来自鼻咽慢性炎症患者活检标本)及5株细胞系(EBV阴性的鼻咽上皮永生化细胞NP69和鼻咽癌细胞HK-1, EBV阳性的鼻咽癌细胞C666-1、淋巴瘤细胞Raji及狨猴B细胞B95-8)。发现正常鼻咽上皮组织和EBV阴性的细胞系中,均检测不到EBV编码miRNAs及LMP1、 EBNA1的表达；而16例鼻咽癌组织及EBV阳性细胞系中,都有BART组40个EBV miRNAs及LMP1、 EBNA1的表达,其中14例鼻咽癌组织为高表达；BHRF1组miRNAs则仅在B细胞来源的细胞系Raji及B95-8中有表达,在上皮来源的组织和细胞(不论是正常鼻咽上皮还是鼻咽癌)中均不表达。2、预测EBV miRNA的宿主靶基因由于BHRF1组的miRNAs在鼻咽癌及对照组织中均不表达,我们只对BART组的EBV miRNAs利用TargetScan和RepTar两个生物信息学软件进行了宿主靶基因的预测；TargetScan预测发现BART组EBV miRNAs共有5569个潜在的宿主靶基因,而RepTar预测了6494个BART组EBV miRNAs潜在的宿主靶基因,其中两个软件共同预测出的潜在宿主靶基因有3140个。EBV BART组40个成熟miRNAs中,BART-18-5p有148个潜在的宿主靶基因,数目最多,而BART-8、 BART-13*和BART-19-3p则没有预测到潜在的宿主靶基因。将这3140个潜在的宿主靶基因输入DAVID软件中进行功能聚类分析,发现这些靶基因涉及axon guidance、 pathways in cancer、the Wnt signaling pathway、regulation of the actin cytoskeleton及adherens function等信号通路。3、EBV miRNAs潜在宿主靶基因与鼻咽癌转录组数据的整合分析尽管我们预测了EBV BART组miRNAs可能调控3140个宿主靶基因的表达,但生物信息学预测的结果需要实验证据的进一步支持和验证。大多数情况下miRNAs是其靶基因的负调控因子,由于EBV BART组miRNAs在鼻咽癌中都是表达上调的,那么它们的宿主靶基因理论上将表达下调。为此,我们利用SAM软件重新分析了本实验室已有的鼻咽癌全基因组表达谱数据,发现与正常对照组织相比,鼻咽癌中有732个基因的表达显著失调,其中上调基因270个,下调基因462个。将462个鼻咽癌中显著下调的基因与预测出的3140个EBVmiRNAs潜在宿主靶基因进行比较,最后发现105个基因在鼻咽癌中显著下调,且它们的mRNA也被两个生物信息学工具TargetScan和RepTar同时预测到具有EBV miRNAs的结合位点,因此这105个基因最有可能是EBV miRNAs在鼻咽癌细胞中真正的宿主靶基因。4、绘制EBV miRNA和宿主靶基因间的调控网络我们对这105个在鼻咽癌中表达下调且具有EBV miRNAs结合位点的基因进行进一步分析,发现40个EBV BART miRNAs中有28个miRNAs至少靶向这105个基因中的一个,其中BART-22有37个靶基因、BART-8*有23个、BART-18-5p有12个、BART-9和BART-14各有11个靶基因。类似的,有些基因如ATRX、BTRC、CTBP2、FOXP1和NFIB等在它们mRNA的3’-非翻译区有多个EBV miRNAs的结合位点。在这105个宿主基因和28个EBV BART miRNAs中我们一共找到了175个miRNA:mRNA对,为了充分展示EBV miRNAs和宿主基因mRNA间的调控关系,我们利用Pajek软件绘制了它们间的调控网络图。5、初步验证BTRC是EBV miRNA BART-10的靶基因本研究室曾朝阳副研究员等通过全基因组表达谱分析并经组织微阵列大样本验证了鼻咽癌中WNT信号通路的异常激活与EBV的感染密切相关,本课题中我们发现WNT通路中关键分子BTRC是EBV miRNAs的潜在靶基因,且在鼻咽癌中显著下调,因此本课题中我们初步验证了EBV miRNAs对BTRC的调控。尽管BTRC基因3’-非翻译区预测有多个EBV miRNAs的结合位点,我们经过初步实验发现只有EBV miRNA BART-10对BTRC的调控作用最为明显。在鼻咽癌和正常对照临床样本中,我们发现EBV miRNA BART-10与BTRC的表达显著负相关；在鼻咽癌细胞系中转染EBV miRNA BART-10的mimics后,通过Real-time PCR和Western blotting我们在mRNA和蛋白水平都验证了EBV miRNA BART-10能下调内源性BTRC的表达；最后,采用荧光素酶报告基因实验我们证实了EBV miRNA BART-10确实可以靶向BTRC mRNA的3’-非翻译区直接调控该基因的表达。以上结果表明在鼻咽癌中BTRC下调的原因很可能就是受到EBV miRNA BART-10的调控,并进一步通过BTRC下游信号通路级联反应而发挥生物学效应。综上所述,本课题绘制了一个全面的EBV编码miRNAs的表达谱,并通过生物信息学预测结合鼻咽癌转录组数据获得了EBV编码miRNAs与宿主靶基因间的调控网络,对我们进一步探讨EBV通过编码miRNAs在鼻咽上皮癌变过程中发挥作用的分子机制提供了新的线索。从EBV miRNA与宿主靶基因调控网络中,我们挑选了BART-10与WNT通路关键分子BTRC进行了初步实验验证,BART-10通过BTRC如何进一步调控WNT信号通路,影响哪些细胞生物学表型,值得进一步深入探讨。