大肠杆菌O157为食源性病原菌，可引起严重的食物中毒，及致人死亡，建立特异快速的检测方法是目前控制食品安全的关键。大多数大肠杆菌O157产Vero毒素（VT），已知VT是大肠杆菌O157感染引起溶血性尿毒综合征的主要毒力因子之一，检测VT可以直接判定样本是否具有致病性毒素。本课题建立了大肠杆菌O157快速灵敏的基因检测方法和制备了VT的单克隆抗体，两者结合应用既可以检测大肠杆菌O157的毒力基因又可以检测基因产物，可根据不同条件选择不同的检测方法以提高样本的检测率。 根据GenBank中编码大肠杆菌16s rRNA的基因、rfbE（O157抗原基因）、vt1（Vero毒素1基因）、vt2（Vero毒素2基因）和eaeA（紧密素基因）5种基因的特异性序列，设计合成5对引物，建立了快速鉴定大肠杆菌O157的多重PCR方法。该方法的检测敏感度为细菌纯培养物为10⁴CFU／ml，鸡肉组织样品含菌3-4CFU／g经预增菌8h后能检出。用此方法检测2000-2004年间临床分离的64株动物组织和粪便的菌株，结果10株鉴定为大肠杆菌O157，其中8株能扩增上述5条特异性条带，与预期产物完全一致，2株能扩增出除vt1基因外的4条特异性条带，其他54株菌株只能扩增出大肠杆菌16s rRNA，与血清凝集试验结果完全吻合。该方法通过预增菌能检测动物源性食品中的大肠杆菌O157，且能从基因水平直接鉴定该菌是否产VT，特异性强，为检测和鉴定大肠杆菌O157提供了一个新方法。 以大肠杆菌O157 DNA为模板扩增VT2-B亚单位，纯化后经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，导入带有谷胱甘肽S转移酶（GST）的融合表达载体pGEX_4T-2，构建重组表达质粒pGEX_4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，实现了VT2-B-GST融合蛋白的高表达，表达量约占菌体总蛋白的35％，为可溶性蛋白。经GST亲和层析柱纯化，得到纯度较高的VT2-B-GST融合蛋白。 用纯化的VT2-B-GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0融合，用间接ELISA筛选融合蛋白的阳性克隆，剔除与细胞壁杂蛋白交叉反应的阳性孔，再用有限稀释法获得单克隆，最后获得2株针对VT2-B亚单位的单克隆抗体细胞株：4B×F10×D4和4B×8G×11F。将10⁵-10⁷个4B×8G×11F细胞注射到BALB／C小鼠腹腔，制备腹水，ELISA效价为10⁴。用Western blot鉴定此单抗，结果与融合蛋白反应呈阳性，与GST蛋白反应呈阴性，证明此单抗为抗VT2-B亚单位的特异性单