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S100蛋白属于EF手相钙结合蛋白家族成员,S100蛋白的功能分为两大类：细胞内功能和细胞外功能。研究发现S100蛋白在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。本实验室前期工作发现该家族的成员之一S100A14在食管癌中存在差异表达,S100A14在食管癌中的表达上调与淋巴结转移正相关,过表达S100A14可促进细胞的侵袭和迁移能力。为进一步完善S100A14在食管癌中的功能研究,我们在食管癌细胞系中探讨了S100A14的细胞外生物学功能。首先我们将原核表达的His-S100A14蛋白加入到食管癌细胞外液中,MTT实验和流式细胞术实验发现低剂量S100A14蛋白可以促进细胞增殖,S期明显上升。同时,低剂量S100A14还可促进细胞存活,减轻Dox (0.5μM)和H2O2(100μM)引起的细胞损伤反应。机制研究表明低剂量S100A14可以激活p-ERK和NF-κB,且这种激活作用可被U0126所抑制。RAGE (Receptor for Advanced Glycosylation End products,晚期糖基化终末产物的受体)是目前公认的S100家族蛋白的受体,免疫共沉淀实验发现：S100A14与RAGE受体有直接相互作用。为探讨外源S100A14蛋白是否通过与RAGE受体的相互作用而发挥功能,我们建立了稳定过表达RAGE全长和RAGE显性负效应突变体(RAGE-Acyto)的KYSE180细胞系,siRNA干扰RAGE表达、过表达RAGE-Acyto或者加入RAGE的拮抗性多肽(AmphP)都可以显著减轻低浓度S100A14蛋白对细胞的增殖以及对p-ERK和NF-κB的激活。低浓度S100A14蛋白通过与RAGE受体的相互作用引起p-ERK和NF-κB的激活进而促进细胞增殖和存活。我们还寻找了EF手相中与蛋白发挥功能密切相关的关键性氨基酸,结果显示N端EF手相中的E39位和E45位氨基酸(E39A, E45A)突变可明显减弱该蛋白的促增殖作用及对p-ERK的激活,因此这两个位点对于蛋白功能的发挥至关重要。相对高剂量S100A14蛋白对细胞有明显损伤作用,高浓度S100A14蛋白可引起线粒体途径的细胞凋亡,干扰RAGE的表达或功能显著减轻了高浓度S100A14蛋白的损伤作用,但并没有完全逆转。说明高浓度S100A14蛋白导致细胞凋亡是部分依赖于RAGE受体的,可能还有其他的受体或机制参与此过程。机制研究发现胞内活性氧自由基(ROS)在S100A14蛋白引起的凋亡过程中扮演了重要角色。外源加入低浓度S100A14蛋白可促进细胞侵袭,上调MMP-2的表达,但对迁移和划痕愈合能力无影响。此外,外源加入低浓度S100A14蛋白还可以促进内源性S100A14的表达上调。本课题的研究证明外源加入不同浓度S100A14蛋白通过与胞膜上RAGE受体的相互作用激活了胞内不同信号通路而引起不同的生物学效应,为进一步阐明S100A14蛋白在食管癌进展中发挥的重要功能提供了理论依据。