研究背景:唾液腺腺样囊性癌（Salivary Adenoid Cystic Carcinoma,SACC）,是发生于唾液腺的恶性肿瘤,生长缓慢,侵袭性强,中晚期时可通过血行转移至肺、肝、骨等器官。肿瘤转移是复杂的生物学行为,受到多种因素影响,其中较为重要的便是肿瘤微环境。肿瘤微环境是由肿瘤细胞所处的细胞外基质及其他间质细胞、可溶性细胞因子等构成。癌相关成纤维细胞（Cancer-associated Fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最重要的间质细胞之一,参与调控肿瘤转移。本课题组前期研究证实SACC的间质中同样存在CAFs,并通过分泌基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase,MMPs）等促进SACC的迁移和侵袭,但CAFs对于SACC转移的作用尚未见明确报道。近年,转移前微环境（Pre-metastatic niche）在肿瘤转移中的作用被广泛关注。转移前微环境是指肿瘤细胞分泌的可溶性因子在瘤细胞达到靶器官之前进入远端器官,构建适合肿瘤细胞黏附和克隆性增殖的微环境。构建后的微环境具有如下特征:（1）血管通透性增加;（2）细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）重构;（3）骨髓来源细胞（Bone Marrow-derived Cells,BMDCs）募集。随着研究的深入,肿瘤细胞的产物被证实可以调控转移前微环境的构建,包括肿瘤分泌的可溶性因子和细胞外囊泡等。外泌体（Exosomes）作为细胞外囊泡的最主要成分之一被证实参与了转移前微环境的构建。外泌体是细胞分泌的具有脂质双分子层结构的小囊泡,粒径范围为30nm-150nm,作为运载工具包裹DNA、RNA和蛋白质,参与细胞与细胞间的信息传导。肿瘤来源外泌体通过与受体细胞结合,参与肿瘤的血管新生、侵袭和转移等多种生物学过程。然而,CAFs外泌体参与的转移前微环境构建却未见报道。研究目的:本研究目的包括三方面,首先,揭示CAFs及其外泌体在SACC肺转移及转移前微环境构建中的作用;其次,阐明CAFs外泌体构建肺转移前微环境的分子机制;最后,探究CAFs外泌体促进SACC肺转移及其转移前微环境构建的临床意义。本研究可望为SACC肺转移的早期诊断提供可靠的生物学标志物,并为抑制SACC肺转移提供治疗靶点。材料方法:1.揭示CAFs及其外泌体与SACC肺转移和转移前微环境构建中的作用收集大连医科大学附属第一医院2例SACC患者外科手术切除的原位肿瘤,原代提取CAFs,命名为CAF-A1和CAF-A2。利用外泌体提取试剂盒Total Exosome Isolation提取SACC-LM、CAF-A1和CAF-A2细胞外泌体。通过BALB/c裸鼠腹部皮下注射瘤细胞构建肿瘤自然转移动物模型,考察CAFs与SACC转移相关性,实验分为SACC-LM、SACC-LM联合CAF-A1、SACC-LM联合CAF-A2注射组,每组注射细胞总数保持一致。通过C57BL/6J小鼠尾静脉注射外泌体和SACC-LM构建肺转移动物模型,考察CAFs外泌体与SACC肺转移相关性,实验结束后收集小鼠的肺组织和肝组织,通过冰冻切片免疫荧光染色鉴定转移灶。通过BALB/c裸鼠腹部皮下移植瘤动物模型,考察CAFs与SACC肺转移前微环境形成的相关性,实验组分为SACC-LM、SACC-LM联合CAF-A1、SACC-LM联合CAF-A2注射组,未注射任何细胞的小鼠作为对照组。实验第3周收集肺组织,通过免疫荧光染色鉴定转移前微环境。通过C57BL/6J小鼠尾静脉注射不同细胞来源的外泌体,考察外泌体与肺转移前微环境形成的相关性;实验周期的第1天、3天、7天和14天收集肺组织,鉴定转移前微环境的形成。2.阐明CAFs外泌体构建肺转移前微环境的分子机制利用ITRAQ蛋白相对定量技术,对SACC-LM、CAF-A1和CAF-A2细胞外泌体总蛋白进行两两比对,筛选CAFs外泌体中的高表达蛋白。通过差异蛋白的信号通路富集分析,筛选相关信号通路,并与差异蛋白进行交集分析,确定目的蛋白。通过蛋白免疫印迹实验（Western blot）验证目的蛋白表达趋势。利用免疫荧光染色技术和外泌体体外黏附实验探寻CAFs外泌体的靶细胞。同时,利用肿瘤细胞黏附实验进一步阐述CAFs外泌体作用靶细胞后对肿瘤细胞黏附和增殖的影响。3.探究CAFs外泌体构建转移前微环境的临床意义收集转移发生前的小鼠外周血,提取外泌体,通过Western blot考察Integrinβ1的表达。收集15例SACC患者原位肿瘤并统计患者的肺转移情况,将原位肿瘤制成石蜡切片,利用免疫组织化学染色鉴定原位肿瘤间质中FAP和Integrinβ1的表达,并比较转移组及非转移组的差异。实验结果:1.CAFs及其外泌体参与SACC肺转移和转移前微环境构建外泌体提取后通过透射电镜及Western blot验证,观测到典型的外泌体形态及标志物的表达。BALB/c裸鼠自然转移动物模型实验结果显示,与肿瘤细胞单独注射组相比较,联合CAFs注射组中转移灶数量及面积显著升高（*p＜0.05,**p＜0.01）,提示CAFs促进SACC的肺转移。C57BL/6J小鼠动物模型实验结果显示CAFs外泌体注射组肺转移灶数量及面积均显著高于肿瘤细胞外泌体注射组（**p＜0.01）。结果提示,CAFs外泌体促进肿瘤转移的能力高于肿瘤细胞外泌体。利用BALB/c裸鼠转移前微环境动物模型评价CAFs与SACC肺转移前微环境的相关性实验结果显示,肿瘤细胞单独注射组和肿瘤细胞联合CAFs注射组的肺组织均表达FN、LOX、MMP9和VEGFR1,其中FN和LOX在联合CAFs细胞注射组中呈现高表达,提示CAFs促进转移前微环境构建。利用C57BL/6J小鼠转移前微环境动物模型评价CAFs外泌体与SACC肺转移前微环境的相关性实验结果显示:（1）CAFs外泌体定植于肺部,同时增加血管通透性的的能力显著高于肿瘤细胞外泌（**p＜0.01）;（2）CAFs外泌体处理组小鼠肺组织中FN、LOX和MMP9的表达显著高于肿瘤细胞外泌体处理组;（3）诱导14天后,肿瘤细胞外泌体和CAFs外泌体注射组均出现VEGFR1阳性的BMDCs,但三组未见显著性差异（p＞0.05）。以上结果提示,CAFs外泌体主要通过重构肺组织ECM促进转移前微环境的形成。2.CAFs外泌体高表达特殊的ECM成分参与肺转移前微环境构建ITRAQ相对定量技术筛选出CAFs外泌体参与转移前微环境构建的关键蛋白,其中包含多种与转移前微环境形成相关的特殊ECM成分,如POSTN、LOXL2等。此外,一些与细胞黏附相关的蛋白也在CAFs外泌体中高表达,如整合素-β1（Integrinβ1）。Western Blot实验验证了ITRAQ的实验结果。为寻找Integrinβ1的整合素-α（Integrinα）配体,我们检测了CAFs细胞外泌体中Integrinα2、Integrinα4、Integrinα6的表达,结果发现Integrinα2表达于CAFs外泌体中,而Integrinα4和Integrinα6未见表达。我们提取了小鼠肺成纤维细胞（Lung fibroblasts,LF）,将肿瘤细胞的CAFs的外泌体加入在LF培养液中,结果发现CAFs外泌体可以靶向LF;并且,我们将肿瘤细胞加入到外泌体处理过的LF细胞培养孔中,结果发现CAFs外泌体诱导的LF组中肿瘤细胞的黏附数量及克隆灶面积显著高于肿瘤细胞外泌体诱导组。3.探究CAFs及其外泌体促进SACC肺转移和转移前微环境形成的临床意义构建小鼠皮下移植瘤模型,分为三组,即对照组、SACC-LM注射组、SACC-LM联合CAF-A1注射组、SACC-LM联合CAF-A2注射组。收集转移发生前小鼠的外周血,提取外泌体,Western blot实验检测Integrinβ1的表达情况。结果显示对照组小鼠血浆外泌体基本不含有Integrinβ1,而三个实验组小鼠血浆外泌体均高表达Integrinβ1,而且SACC-LM联合CAF-A1和CAF-A2注射组的Integrinβ1的表达均高于单独注射SACC-LM组。SACC患者原位肿瘤的FAP和Integrinβ1免疫组织化学染色结果显示,肺转移患者的间质高表达FAP和Integrinβ1,显著高于无转移组。结论:1.CAFs外泌体通过构建转移前微环境促进SACC肺转移。2.CAFs外泌体携带特殊的ECM成分促进肺转移前微环境的形成。3.CAFs外泌体通过Integrinα2β1识别肺成纤维细胞,提高成纤维细胞的促肿瘤细胞黏附和增殖能力。4.Integrinβ1阳性外泌体有望作为液体活检的指标。