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食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一,主要病理类型以鳞癌为主。虽然我国现在对食管鳞癌的诊疗水平有很大提高,但由于其早期患者对它的忽略及其侵袭、转移使其临床进展迅速,预后较差,由于大多数患者就诊时已属中晚期,失去了手术的机会,且临床观察发现放化疗并未能明显延长患者的生存期,且使患者的生活质量下降,因此从分子水平去探讨食管癌发生、发展,从基因水平上防治该病具有重要的现实意义和理论价值。实验室研究发现非蛋白质编码微小RNA(micro RNA,mi RNA)是具有调控功能的非编码RNA。研究发现mi RNA参与了调控细胞增殖和凋亡,在肿瘤的发生发展过程中扮演了重要的角色,其中mi R-451是消化道肿瘤的研究热点。2005年,Altuvia在位于染色体17qll.2上发现了mi R-451,通过长期的实验研究发现,mi R-451参与并调控了许多诸如:血液系统疾病中造血的分化、各种不同上皮细胞极性建立和维持、胚胎发育及成熟、心脑血管疾病的发生,神经的发育、各种不同肿瘤细胞形成的生理及病理进展过程。研究发现mi R-451在多种肿瘤组织中表达异常,并且参与了某些肿瘤的生物学行为。【目的】藤梨根是常用的抗肿瘤中药,可通过多种途径发挥抗肿瘤作用,其药理研究和临床验证受到广泛关注。本课题组前期研究表明,藤梨根提取物可调控食管鳞癌细胞中多种基因的m RNA的表达,近期研究发现这多种基因调控的表达和非蛋白质编码微小RNA 451的表达上调有关。本课题旨在探讨mi R-451作用靶基因调控食管鳞癌细胞生长、周期、侵袭和凋亡的机制。为食管癌的中药治疗提供潜在的靶点及实验依据。【方法】(1)藤梨根提取物的制备,用MTT法检测藤梨根提取物(RAE)的细胞毒性作用,找到无毒浓度进行试验;(2)运用RT-PCR检测食管鳞癌细胞株中mi R-451表达水平;(3)体外调控mi R-451表达对食管鳞癌细胞EC9706生物学行为的影响;(4)制备不同浓度的藤梨根提取物干预食管鳞癌细胞株的生长,并再次运用RT-PCR检测食管鳞癌细胞株中mi R-451表达水平。【结果】1.RAE对食管鳞癌细胞有毒性作用,这一定程度上与RAE剂量的多少有着密切的联系。当RAE浓度低于或等于10μg/ml时,与空白对照组相比,对于细胞的抑制率统计学差别不大(P>0.05),RAE100μg/ml和1mg/ml两组抑制率分别为18.9%、31.1%,与对照组比较有显著意义(P<0。05)。2.mi R-451Agomir组的mi R-451的相对表达量是15.84±3.07,对比空白对照组,表达水平显著上调(P<0.01);mi R-451Agomir组细胞Bcl-2、AKT和CDKN2D表达均显著下调(P<0.05);mi R-451Agomir组平均侵袭细胞数为45.4±6.4,与对照组比较显著降低(P<0.01);mi R-451Agomir组G0/G1细胞比例增加至77.54%,S细胞比例显著降低至16.03%,G2/M期细胞比例显著降低至6.43%,与对照组比较差异具有显著性(P<0.05)。3.RT-PCR法分别检测两组细胞mi R-451的表达,对照组的10个样本中有1个mi R-451呈高水平表达,其余9个呈低水平表达;实验组的10个样本中有8个mi R-451基因呈高水平表达,其余2个呈低水平表达。统计学分析表明mi R-451基因在两组的表达程度上有显著性差异(P<0.05)。结论:1.不同浓度RAE存在的细胞毒性不同,在一定范围内与其剂量的多少相关。当其浓度小于或者等于10μg/ml时,其抑制率较小,为非细胞毒性浓度。2.体外调节食管鳞癌细胞EC9706中mi R-451的表达,使之上调,对CDKN2D,AKT,BCL-2,进行调节,在一定程度上能够减慢癌细胞生长的速度,促使肿瘤细胞的发展多停留在DNA合成前期,DNA合成期及有丝分裂期减少,进而削减细胞的侵袭能力,促使癌细胞凋亡速度加快。3.RAE在一定的浓度范围内可以上调mi R-451的表达水平,这是藤梨根治疗食管癌的重要方法,并且可以通过相关靶基因对食管癌细胞的生长速度、侵袭能力的强弱及其凋亡速度等进行一定的调控。