背景及目的:恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重疾病之一。恶性肿瘤及其转移灶的早期诊断是患者预后的重要决定因素。在过去的几十年中,医学成像设备的发展使肿瘤诊断得到质的提高,如超声、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)等普遍而有效的检查设备。但这些检查方法并不能从本质上区分病变的良恶性,而且对一些小的病灶不易发现。正电子发射断层扫描(PET)是目前鉴别占位性病变良恶性的最佳方法,但PET有时对炎性占位和恶性肿瘤不易辨别。近年来新发展起来的肿瘤特异性成像技术,能够借助肿瘤标记物从根本上区分恶性肿瘤和正常组织。肿瘤特异性显像技术是指利用恶性肿瘤的标记物作为靶向元件,定向导入报告基因如荧光蛋白或荧光素酶,使其在肿瘤细胞内特异性的表达,采用高敏的体外检测设备捕获瘤内报告基因发出的荧光信号,从而对肿瘤的生长、侵袭、转移以及对治疗的反应进行实时无创的监测。肿瘤特异性显像技术的第一步是如何选择肿瘤靶向元件,使报告基因在肿瘤细胞内特异性表达。过去研究者倾向于选择组织特异性肿瘤标记物如癌胚抗原CEA,甲胎蛋白AFP及前列腺特异抗原PSA等。利用他们的抗原性或者利用他们的基因启动子作为靶向元件,进行肿瘤特异性的诊断或治疗研究。但是这些组织特异性肿瘤标记物都只针对特殊组织发挥作用,应用范围局限于某一特定来源的肿瘤,不能作为广谱的肿瘤特异性标记物用于研究。端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白酶。人端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR)、端粒相关蛋白1(TP1)和端粒酶逆转录酶(hTERT)组成。近年来的研究表明,hTERT是端粒酶复合物中的限速成分,与端粒酶一样,它在绝大多数肿瘤中表达,而在正常体细胞中少有表达。hTERT的这种肿瘤特异性表达的特性,使其成为近年来最受欢迎的广谱肿瘤特异性标记物,在肿瘤靶向的诊断及治疗中受到越来越广泛的应用。由于hTERT的表达受hTERT启动子的调控,基于hTERT的广谱肿瘤特异性,hTERT启动子也为许多研究者用于肿瘤靶向性诊断及治疗的研究。有研究表明,hTERT启动子的核心序列长约260bp,其中有含有一种E-box序列(CACGTG),该序列可以和原癌基因c-myc家族编码的一种螺旋-环-螺旋拉链基元蛋白因子结合而上调hTERT的表达。小动物无创活体显像平台是由高敏感CCD摄像探头检测动物体内发出的微弱荧光信号。报告基因如GFP或luciferase在体内发射出的荧光信号极弱,而且当其透射出体外时往往伴有动物皮毛或粪便的自发荧光的干扰。最新的平台采用超冷探头能够检测极微弱信号,同时采用多光谱滤光片能够滤去报告基因波长范围外的杂光,得到高质量的图像。其在医学研究中的主要优点是无创性、可对小动物进行整体成像、可长时反复成像。基于以上分析,本研究采用hTERT启动子作为肿瘤靶向性元件,为提高其在肿瘤细胞中的活性,降低其在正常体细胞中的活性,根据文献报道对其序列进行优化改建。在改建后的hTERT启动子下游加载GFP报告基因,由可整合的慢病毒转移至裸鼠的肿瘤细胞内表达,采用激光共聚焦或小动物荧光成像系统,体内外研究基于hTERT启动子的慢病毒对恶性肿瘤的靶向性成像能力。在此基础之上,将hTERT启动子下游加载治疗基因胞嘧啶脱氨酶(CD)和报告基因GFP同时表达,将其构建成hTERT启动子靶向的治疗慢病毒,并通过激光共聚焦或小动物荧光成像系统,体内外实时无创性研究基于hTERT启动子的治疗性慢病毒对恶性肿瘤的靶向杀伤作用。为基于hTERT启动子的活体光学实时成像技术在肿瘤诊断及治疗效应评估中的应用提供理论依据。研究方法1. hTERT启动子设计及功能检测:根据文献优化设计并合成hTERT启动子,将其克隆到标准的启动子功能检测系统pGL3-basic质粒中,同时构建含CMV、SV40或野生型hTERT启动子的对照组。采用双荧光素酶实验测定启动子在端粒酶阳性或阴性的肿瘤细胞以及原代培养的成纤维细胞中的活性,以确定优化型hTERT优化型启动子的端粒酶靶向性。2.基于hTERT优化型启动子肿瘤靶向性活体光学成像在肿瘤诊断中作用的研究:采用第三代慢病毒转移质粒作为骨架质粒,将GFP报告基因克隆至其多克隆位点,构建CMV启动子驱动GFP表达的慢病毒载体(pLenti-CMVp-GFP);将hTERT优化型启动子替代CMV启动子,构建hTERT启动子驱动GFP表达的慢病毒载体(pLenti-hTERTp-GFP)。四质粒包装系统包装并浓缩病毒,采用荧光定量PCR检测病毒滴度。体外实验:将上述两种慢病毒分别体外感染端粒酶阳性肿瘤细胞或端粒酶阴性的肿瘤细胞和原代培养的成纤维细胞,采用激光共聚焦观察GFP的表达;体内试验:构建皮下生长端粒酶阳性或阴性的荷瘤裸鼠模型,并将上述两种病毒分别瘤内注射,采用活体成像系统观察上述两种慢病毒对肿瘤的靶向性显像,进一步采用组织化学技术检测肿瘤组织内GFP蛋白的表达。3.基于hTERT优化型启动子肿瘤靶向性活体光学成像在肿瘤治疗效应实时无创评估中作用的研究:以pLenti-hTERTp-GFP作为骨架质粒,在优化型hTERT启动子下游克隆CD自杀基因(pLenti-hTERTp-CD/GFP),以pLenti-hTERTp-GFP作为阴性对照。四质粒包装系统包装并浓缩病毒,采用荧光定量PCR检测病毒滴度。体外实验:将上述慢病毒体外感染端粒酶阳性和阴性的肿瘤细胞,并检测GFP和CD的表达;在感染了病毒的细胞内加入CD前药5-FC,并采用MTT实验检测细胞的存活率,以确定该治疗型病毒在体外对细胞是否产生杀伤效应。体内试验:构建端粒酶阳性和端粒酶阴性皮下荷瘤裸鼠模型,将上述两种慢病毒分别瘤内注射,感染后一周给裸鼠腹腔注射前药5-FC,在活体成像仪下观察病毒对肿瘤生长的抑制过程以及整体动物水平下肿瘤生长的特点,全程测量并记录肿瘤体积的变化;进一步组织学检测肿瘤CD蛋白的表达,激光共聚焦显微镜下观察GFP蛋白的表达。结果1.双荧光素酶实验发现hTERT优化型启动子能够在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异性表达荧光素酶,且其表达水平与CMV、SV40启动子接近,略高于野生型hTERT启动子;而在端粒酶阴性肿瘤细胞和原代培养的成纤维细胞内不表达荧光素酶。提示该优化型hTERT启动子具有在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达下游基因的能力,由于端粒酶在85%以上的恶性肿瘤中表达,因此,hTERT优化型启动子可以作为肿瘤靶向元件用于肿瘤活体荧光成像。2.酶切及测序证实成功构建了含有hTERT启动子驱动GFP表达的慢病毒质粒(pLenti-hTERTp-GFP)及CMV启动子驱动GFP表达的对照质粒(pLenti-CMVp-GFP)。病毒包装后检测其滴度达108数量。体外实验发现pLenti-hTERTp-GFP慢病毒能够在端粒酶阳性肿瘤的细胞内表达GFP,而在端粒酶阴性的肿瘤细胞以及原代培养的成纤维细胞内不表达GFP,而pLenti-CMVp-GFP慢病毒在端粒酶阳性及端粒酶阴性的肿瘤细胞内均表达GFP,提示pLenti-hTERTp-GFP慢病毒具有明显的端粒酶靶向性。体内试验发现,pLenti- hTERTp -GFP慢病毒感染24小时后,采用活体光学成像系统在端粒酶阳性的荷瘤鼠中就能观察到瘤内荧光,并持续稳定表达30天,荧光范围和强度随肿瘤的生长而扩大增强,能够实时反应肿瘤的位置和大小以及有无转移,而在端粒酶阴性的荷瘤鼠中则未见明显荧光;对照慢病毒pLenti-CMVp-GFP感染后,在端粒酶阳性及端粒酶阴性荷瘤鼠中均可见荧光表达。组织化学检测发现pLenti- hTERTp -GFP慢病毒感染后,只在端粒酶阳性的肿瘤内有GFP蛋白的表达,而端粒酶阴性肿瘤内未见GFP蛋白表达;而对照慢病毒pLenti-CMVp-GFP感染后,在端粒酶阳性及端粒酶阴性肿瘤内均可见GFP蛋白表达。3.酶切及测序证实成功构建了含有hTERT启动子驱动CD和GFP的慢病毒质粒(pLenti-hTERTp-CD/GFP),以pLenti-hTERTp-GFP慢病毒作为空白对照。包装病毒后检测其滴度均达108数量级。体外研究发现pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染细胞后,采用RT-PCR和Western blot技术在端粒酶阳性肿瘤细胞内均可检测到CD和GFP表达,而在端粒酶阴性的肿瘤细胞内未检测到CD和GFP的表达;体外细胞杀伤实验表明,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒感染细胞后能够对端粒酶阳性肿瘤细胞产生显著杀伤效应。体内研究发现在端粒酶阳性的荷瘤鼠模型中,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤体内注射后,肿瘤生长速度明显慢于pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤体内注射的肿瘤,而在端粒酶阴性肿瘤中,无论哪一种慢病毒瘤体内注射,均不会影响肿瘤的生长;进一步组织学检查发现在端粒酶阳性肿瘤中,pLenti-hTERTp-CD/GFP慢病毒瘤体内注射的肿瘤,其CD和GFP均有表达,而pLenti-hTERTp-GFP慢病毒瘤体内注射的肿瘤仅有GFP蛋白表达,在端粒酶阴性的肿瘤中,无论哪一种慢病毒瘤体内注射,均未见CD和/或GFP的表达。结论1.优化后的hTERT启动子具有很好的肿瘤靶向性。可以作为广谱肿瘤靶向元件,应用于肿瘤的靶向显像及靶向治疗。2.含有优化型hTERT启动子驱动GFP的慢病毒在体外和体内均能感染肿瘤细胞,并在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达GFP。结合小动物活体成像平台,该病毒能够对端粒酶阳性肿瘤进行无创的实时荧光成像,为肿瘤的早期特异性诊断和在体生物学行为研究提供依据。3.含有优化型hTERT启动子驱动CD和GFP的慢病毒能够在体外和体内感染肿瘤细胞,并在端粒酶阳性肿瘤细胞内特异表达CD和GFP。在体外感染端粒酶阳性细胞后能对其产生显著的杀伤效应。瘤体内注射后,能长期持续抑制端粒酶阳性肿瘤的生长,结合活体荧光成像系统,可以实时无创地观察到自杀基因在肿瘤内表达的范围和强度,以及对肿瘤生长抑制的全部过程。以上研究显示将hTERT启动子进行优化改建后,在第三代慢病毒的携带下能够在端粒酶阳性的肿瘤细胞内特异表达报告基因或(和)治疗基因,结合小动物活体荧光成像系统,能够在动物整体水平对在体肿瘤进行靶向性实时无创成像,为肿瘤的靶向性诊断及治疗效果的实时无创评估提供了重要的实验依据。由于端粒酶在85%以上的恶性肿瘤中表达,因此对这种实时无创的肿瘤成像方法的深入研究将为肿瘤诊断和治疗提供一种新的诊疗模式。