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目的:本论文以大鼠为实验材料,探讨了LEAP-2在正常大鼠肝脏、大肠、小肠、脾、心脏、脑、肾、胃、肌肉、以及感染大鼠的肝脏等组织材料中的mRNA表达情况并对其中表达丰度量高的肝脏LEAP-2进行了克隆及酵母表达,对真核酵母表达进行了小型发酵工艺流程方向的探索。
方法取正常大鼠肝脏、大肠、小肠、脾、心脏、脑、肾、胃、肌肉、以及感染大鼠的肝脏等组织材料,提取总RNA,借助于G3PDH持家基因进行相对定量,对上述10种组织材料种的LEAP-2mRNA的表达丰度进行了研究;取正常肝脏组织材料,提取总RNA后进行RT-PCR、克隆、转化、筛选阳性克隆并举行序列测定,应用生物信息学对测序结果进行虚拟化分析和同源性比较;经酶切、转化,将LEAP-2基因定向克隆于真核巴斯德毕赤酵母表达载体PA0815,经甲醇诱导表达得到表达产物;应用小型发酵罐对LEAP-2进行工艺流程优化。
结果大鼠LEAP-2的表达丰度从高到低依次为:感染大鼠的肝脏、肝脏、小肠、脾、心脏、大肠、脑、肾、胃、肌肉;克隆了LEAP-2基因全长,获基因登录号:DQ066720;构建了LEAP-2真核巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9/LEAP-2,并成功的进行了甲醇诱导表达,与原核系统表达不同的是,该系统直接表达产物到培养液种,为大量纯化奠定了基础;对LEAP-2基因进行了小型发酵,并对其中一些具体工艺进行了优化,发现1%甲醇、pH6.0、48h是最佳发酵条件
结论大鼠各种组织当中,肝脏LEAP-2表达丰度最高;生物信息学表明:LEAP-2基因及其蛋白质产物是一种相当保守的小分子,提示其意义在进化过程种意义重大;小型发酵试验表明:在1%甲醇、PH6.0、48h的情况下,LEAP-2产物表达量最高。