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研究背景与目的长期以来人们一直认为自身免疫性脑脊髓炎( experimental allergic encephalomyelitis, EAE)是以中枢神经系统(CNS)的髓鞘广泛脱失而轴索结构相对保存为特征的脱髓鞘病变,直到上世纪末期国外学者证实在EAE病灶中均广泛存在轴突损伤。为了寻找克服髓鞘及轴突再生不良的治疗策略,人们进行广泛而深入的研究,但进展缓慢,目前对其尚缺乏有效的治疗方法。一般而言,治疗像EAE这样的疾病无非有以下方法:(1)促进内源性修复机制的活化;(2)通过移植提供外源性成鞘细胞;(3)阻止环境中抑制因子对神经细胞的损害。而目前提高内源性髓鞘再生的临床试验未获成功,第三种方法针对移植环境内有害因子给予静脉内注射免疫球蛋白也未获理想效果,人们更多地寄希望于进行细胞移植来解决EAE这一医学难题。目前发现,应用细胞移植、给予神经营养因子等方法可以部分改善损伤局部的微环境,促进损伤轴突及髓鞘的再生。在此基础上,基因治疗的策略应运而生,给EAE带来了新的希望。嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种新颖的神经胶质细胞,它兼有星形胶质细胞和雪旺氏细胞的双重特性,保留了许多发育阶段的特性和可塑性。它可以协助再生轴突穿越通常无法逾越的胶质瘢痕和中枢神经系统(CNS)的微环境,引导神经长入正确的部位,促进恢复髓鞘和轴突再生;而且,更为重要的是,OECs源于CNS,与CNS的整合及在CNS内的迁移非常自然。另外,它还有易取材、易存活、易接纳重组分子及能长期表达外源基因等特性,是重组基因增殖的理想场所,因而,成为移植供体理想的来源和基因转染较理想的受体细胞。神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)是神经营养素家族众多成员中最有效的一种,其生理功能广泛,在皮质脊髓束及一些大的感觉轴突上均存在NT-3受体,而这些神经司职的正是我们在EAE伤治疗中想得到的运动及感觉功能。研究发现,BDNF主要促进神经元胞体的发育与存活,而NT-3则主要促进轴突与髓鞘的分化与延伸。本研究拟体外培养较高纯度的人胚嗅鞘细胞(Human olfactory ensheathing cells ,hOECs)应用基因工程技术,尝试利用逆转录病毒介导人NT-3基因转染hOECs,构建具有生物活性的OECs-NT-3基因工程细胞,观察其对EAE的治疗作用并探讨其机制,为下一部为自体移植的实现做一些有益的尝试和先期准备工作。方法1、采用原代培养的方法,自人胚胎的嗅球培养出hOECs,然后行抗P75和GFAP染色,SABC免疫组织化学染色,鉴定并计算细胞阳性率。得到较为理想的细胞获取方法,并运用上述纯化后的细胞进行移植。2、提取、纯化逆转录病毒载体PN2A-NT-3,通过阳离子脂质体介导将NT-3转入PA317细胞,用G418筛选阳性克隆,建立PA317-NT-3细胞株。NIH3T3细胞测定病毒上清滴度,把病毒滴度高的上清感染hOECs,并加药筛选,构建hOECs-NT-3基因工程细胞。3、用ELISA方法测定hOECs-NT-3基因工程细胞分泌的NT-3蛋白随时间变化的表达量;RT-PCR检测转染后细胞上清RNA与预期的NT-3条带的长度相符是否相符及表达量;PC12-TrkC细胞共培养实验,观察其表达的NT-3的生物活性;对转染后的细胞行MTT细胞增殖实验,观察转染对其生存的影响。4、建立EAE大鼠模型,应用hOECs-NT-3基因工程细胞移植植入大鼠侧脑室,观察其在宿主环境中分布、迁徒特点;5、从髓鞘及轴突形态学结构、再生神经纤维密度、神经电生理、对神经元的逆行性保护、神经突触素抗体灰度值、运动功能学评分及超微结构等方面,研究hOECs-NT-3基因工程细胞移植对EAE的髓鞘修复及轴突再生的作用。6、探讨hOECs-NT-3基因工程细胞移植对EAE的修复机制,提出基因治疗EAE存在的问题及解决办法。结果1、人胚嗅球来源的hOECs2-8天的细胞纯度可达90%以上;纯化后的细胞活力随培养时间变化而发生变化,纯化后9-10d左右活力最高。根据P75、GFAP免疫细胞荧光染色鉴定,可以作为移植用的种子细胞。2、ELISA方法证实转染组上清液中NT-3含量明显高于未转染组与空载体转染组,此种结果可持续至转染后28天且表达量稳定(第3d、8d、13d、18d、23d、28d的浓度值分别为29.274+0.131、30.367+0.136、30.362+0.146、30.460+0.168、30.363+0.144、30.361+0.140ng/106细胞/24h,P>0.05);RT-PCR检测细胞上清观察到约774bp和258bp特异性条带,与预期的NT3的长度相符;转染组与未转染组浓度值间没有显著差异(P>0.05),表明用转染嗅鞘细胞后,对其增殖能力影响不大;感染后的hOECs可以促进PC12-TrkC细胞的分化,证实其表达的NT-3具有生物活性。3、免疫荧光染色及超微结构形态学观察发现,hOECs-NT-3移植后,可在宿主环境内存活,广泛分布,不仅可以在病灶内迁徙,而且可以在病灶间多点迁徙;脱髓鞘性病灶伤对于hOECs有趋化影响作用;转基因组神经纤维明显增多;形态学观察提示,髓鞘修复程度最好,轴索内线粒体、微丝等细胞器完整,周围髓鞘板层结构清楚,厚度均匀,显著优于单纯hOECs治疗组;髓鞘组化染色结果炎性病灶数显著低于单纯hOECs治疗组(P<0.01)。4、移植28天时,hOECs-NT-3移植组HRP标记的神经元数目及面积明显多于hOECs移植组,差别有显著意义(1858±112.5,561.5±296.5,p<0.01)。移植4周时,hOECs转基因移植组突触素(SYN)抗体染色灰度值显著高于hOECs移植组及对照组(80.02+7.1 ,53.65+8.9,39.08+7.3,P<0.01),提示移植组的神经突触的生长数目明显高于其它组,有利于损伤神经突触的修复,促进神经冲动的传递。5、移植hOECs-NT-3基因工程细胞28天后,单位面积内的神经纤维数目(第14d,28.8±2.2;第28d, 32.5±2.8)明显高于单纯hOECs治疗组第(14d,34.4±3.2;第28d, 38.8±3.4),(P<0.05);运动评分均明显高于单纯hOECs治疗组,差别有显著性意义(P<0.05);且二者之间存在正相关。6、移植hOECs-NT-3基因工程细胞4周后,转基因组组潜伏时间(20.6+0.3ms)与正常相比无显著性差异(P>0.05),波幅也达正常人的(74+7)%;而对照组潜伏期(24.2+0.3ms)仍明显延长,而且波幅亦低,达正常人的(21+2)%,与其它二组比较差异有显著性,(P<0.05)。结论1、利用重组逆转录病毒构建hOECs-NT-3基因工程细胞可以稳定、持久地表达NT-3蛋白,具有生物活性,可以在人胚嗅鞘细胞的后代细胞中发挥作用2、hOECs-NT-3移植后,可在宿主环境内存活,广泛分布,不仅可以在病灶内迁徙,而且可以在灶间多点迁徙,脱髓鞘病灶对hOECs的迁徙有趋化影响作用,其迁徙能力及方向与宿主的内环境有关。3、移植hOECs-NT-3基因工程细胞,能减轻EAE损伤后的逆行性皮质神经元损害、促进脊髓轴突的再生;增加神经元数目和面积,利于损伤神经突触的再生。4、移植hOECs-NT-3基因工程细胞后,神经纤维数目和运动评分均明显增加,且二者之间存在正相关,对EAE损伤后肢体运动功能的恢复有明显的促进作用。5、移植hOECs-NT-3基因工程细胞后,形态学及电生理研究证实,可显著促进髓鞘再生,提高神经传导速度。6、基因修饰的hOECs分泌持续、足量的NT-3,起到很好的协同作用,治疗EAE效果优于单独移植hOECs。7、基因治疗EAE技术真正应用到临床治疗中尚存在一些瓶径问题,我们的工作为下一步自体移植的实现做了有益的尝试和先期准备。