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棉花是我国重要的经济作物,是关系国计民生的重要物资。随着工业发展和人民生活水平的提高,人们对高质量纺织品的需求量逐步增大,因而纺织工业对棉纤维品质的要求更高。棉花纤维是由胚珠表皮分化而来的不分枝的单细胞毛状突起,其突起细胞数目及纤维长度等指标直接与棉花产量和品质相关。研究棉纤维分化和发育的分子机制,克隆棉纤维发育相关基因,对于棉纤维品质改良具有重要意义。油菜素内酯(BR)是一种重要的植物激素,对棉纤维细胞起始分化和伸长生长都有重要作用。为探讨影响棉花纤维发育的BR信号通路,本文研究了Gh14-3-3与BZR1等靶蛋白的相互作用及BR信号在棉纤维发育中的调控作用,取得如下主要研究结果：1.Gh14-3-3h基因克隆鉴定及表达分析本实验室在先前的研究中分离鉴定了7个棉花14-3-3基因。在此基础上,利用酵母双杂交技术,从棉花纤维cDNA酵母双杂交文库中筛选到一个新的14-3-3蛋白,命名为Gh14-3-3h。利用PCR扩增技术,克隆了该蛋白基因的DNA全长序列和cDNA序列。序列分析表明,Gh14-3-3h基因含有6个外显子和5个内含子,属于￡型。Gh14-3-3h蛋白与其它物种的14-3-3蛋白氨基酸同源性达到610%-92%,具有14-3-3蛋白典型的结构特征,具有九个保守的α螺旋结构,但其N端和C端都不保守。利用荧光定量PCR技术分析了Gh14-3-3h在棉花组织中的表达谱。结果表明,Gh14-3-3h基因在纤维中优势表达,而在其它组织中表达量较低。在棉纤维发育过程中,Gh14-3-3h基因在棉纤维发育早期(3-10DPA)表达量较高,而在纤维细胞次生壁发育时期表达量逐步下降。并且,在胚珠离体培养的条件下,用2,4-表油菜素内酯(BL)处理棉花10天纤维,发现Gh14-3-3h表达量显著上调。这说明Gh14-3-3h在棉纤维细胞起始和伸长过程中发挥一定的调控作用,而且可能涉及到棉纤维发育中的BR信号应答。2.Gh14-3-3互作蛋白筛选及蛋白质相互作用验证为了研究Gh14-3-3在棉花纤维发育中涉及的调控信号通路,利用酵母双杂交系统,以Gh14-3-3f/g/h为诱饵蛋白,筛选棉花纤维cDNA酵母双杂交文库,获得了32种蛋白。它们可分为6大类,分别是14-3-3蛋白、BR等激素相关蛋白、代谢相关蛋白、信号相关蛋白、生长发育相关蛋白及功能未知蛋白。将这些蛋白序列在棉花EST公共数据库中进行比对分析,发现这些互作蛋白都能在棉纤维EST库中找到其同源序列,说明Gh14-3-3蛋白可能与这些蛋白在棉花纤维细胞中发生相互作用,共同调节棉纤维生长发育。14-3-3蛋白是一类高度保守的小分子调节蛋白,通常以同源或异源二聚体形式存在。在筛选的棉花14-3-3互作蛋白中,有大约2.8%是14-3-3蛋白本身,这表明14-3-3蛋白确实能够形成同源或异源二聚体。因此,我们进一步验证了Gh14-3-3h蛋白与其它5个Gh14-3-3蛋白之间的相互作用。结果表明,Gh14-3-3h能够与其它Gh14-3-3蛋白特异性相互作用,形成异源二聚体。因此,我们推测这些14-3-3蛋白可能以二聚体的形式参与棉花纤维细胞发育的调节。3. GhBZR1与Gh14-3-3蛋白相互作用分析在上述所筛选鉴定的棉花14-3-3互作蛋白中,有一个与拟南芥BZR1具有较高同源性的蛋白,命名为GhBZR1。对棉花BZR1蛋白序列进行分析,发现有22个可能被BIN2磷酸化的位点,并且有PEST区域和可能与14-3-3相互作用的作用位点。而且,蛋白质亚细胞定位分析表明,GhBZR1分布在细胞质和细胞核中,但受BL诱导后,该蛋白能够在细胞核中大量积累。为研究磷酸化对BZRl与14-3-3相互作用的影响,我们克隆了棉花BIN2蛋白基因。该基因表达与GhBZR1表达有其时空的一致性,都在棉花纤维伸长期优势表达。酵母双杂交和pull down实验证明GhBIN2与GhBZR1能够发生相互作用。在体外磷酸化实验中,GhBIN2能够磷酸化GhBZR1。而且,被磷酸化的GhBZR1能够与Gh14-3-3相互作用。进一步实验证明,GhBZR1与Gh14-3-3蛋白相互作用是通过保守的ModeI基序来完成的,其中第163位磷酸化的丝氨酸(Ser)是二者相互作用的关键位点。这表明被GhBIN2磷酸化的GhBZR1与Gh14-3-3相互作用可能对棉纤维细胞伸长发育发挥重要调控作用。4. GhMYB73与14-3-3蛋白相互作用分析在上述所筛选鉴定的棉花14-3-3互作蛋白中,有一个与拟南芥MYB73具有较高同源性的蛋白,命名为GhMYB73。它在棉花纤维伸长期表达量最高,定位在细胞核中,表明该蛋白可能是一个MYB转录因子。实验表明,GhMYB73可以与拟南芥BR通路中关键转录因子AtBES1在酵母系统中相互作用,推测GhMYB73可能参与BR信号通路。而且,酵母双杂交和pull down实验表明,GhBIN2也能够与GhMYB73蛋白发生相互作用,并在体外磷酸化GhMYB73,而磷酸化的GhMYB73与Gh14-3-3蛋白发生相互作用。这表明GhMYB73可能参与了14-3-3调节的BR信号通路,在棉纤维发育过程中发挥作用。5.Gh14-3-3蛋白在棉纤维细胞发育中的功能分析为研究14-3-3蛋白在棉纤维细胞分化和发育中的调节作用,构建了Gh14-3-3L/e/h等3个基因的RNA干扰(RNAi)表达载体和Gh14-3-3L过量表达载体,转化棉花,获得转基因棉花植株(TO代)及其后代株系(T1-T4代)。对转基因棉花后代株系(T1一T4代)表型观察和遗传分析表明,在RNAi转基因棉花中,纤维细胞起始和伸长发育都受到抑制,导致纤维细胞数目减少,长度变短。Gh14-3-3L/e/h RNAi转基因棉花成熟纤维长度仍然短于野生型,而过量表达Gh14-3-3L棉纤维长度则较野生型长,这表明Gh14-3-3蛋白在棉纤维伸长发育中发挥重要作用。离体胚珠培养实验表明,与野生型相比,Gh14-3-3L RNAi转基因棉花纤维长度和TFU均减少,而过量表达Gh14-3-3L转基因棉花纤维长度和TFU均有所增加。当施加外源BL时,Gh14-3-3L RNAi转基因棉花纤维长度和TFU与未加BL相比虽有所增加,但仍没有恢复到野生型的相当水平。在不添加外源BL的情况下,与野生型相比,Gh14-3-3L RNAi棉花纤维中GhCPD和GhDWF4基因表达显著下降,而在过量表达Gh14-3-3L转基因棉花纤维中GhCPD表达量没有发生改变,GhDWF4表达量则上调。在添加BL后,Gh14-3-3L RNAi棉花纤维中只有GhDWF4表达水平轻微下调。当BL施加后,与野生型相比,两个BR合成相关基因在过量表达Gh14-3-3L棉花纤维中表达量迅速下调。以上结果表明,在棉花纤维伸长阶段,Gh14-3-3可能对BR信号中的反馈调节起着一定的调控作用,从而影响棉花纤维伸长生长和TFU产量。为研究Ghl4-3-3L/e/h RNAi和过量表达棉纤维发育与BR信号调控的关系,检测了一些BR信号通路及纤维发育相关基因在转基因棉花纤维中的表达变化情况。结果表明,GhBZR1、 GhXTH1、GhEXP, GhTUB1和GhCesA5在Gh14-3-3L/e/h RNAi转基因棉花纤维中和Gh14-3-3L过量表达棉花纤维中表达都有不同程度的变化。多代(T1-T4)遗传分析表明,这些基因在不同世代的转基因棉花中的表达都发生改变,具有遗传稳定性。以上结果表明Gh14-3-3蛋白参与调节BR信号通路,通过改变BR信号相关基因的表达水平来影响棉花纤维起始和伸长发育过程。