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肺徽血管内皮细胞(PMVEC)损伤、通透性升高是流感病毒性肺炎重要的病理基础。Ezrin/Radixin/Moesin(ERM)蛋白是细胞膜蛋白与胞内骨架蛋白F-actin的连接蛋白,在血管通透性调节中起重要作用。p38-MAPK、Rho/ROCK、PKC信号通路途径均以ERM为底物参与PMVEC通透性调控,研究已经证实ERM蛋白参与细胞黏附、运动,并参与TNF-α和凝血酶所致微血管内皮细胞的通透性升高。我们的前期研究已表明流感病毒能增加PMVEC的通透性,但ERM相关信号通路在其中的作用,国内外未见报道,需要进一步研究。中医认为,病毒性肺炎主要由毒损肺络和肺络瘀阻所致,治疗应以解毒和通络为主。犀角地黄汤合银翘散(XDY)源于吴鞠通的《温病条辨·上焦篇》,该方以银翘散清解卫分之毒,以犀角地黄汤解营血之毒,两方相合,具有清热解毒、凉血止血、化瘀通络之功效,临床上临证加减用于治疗病毒性肺炎。我们的前期研究表明XDY可能通过作用于PKC-SSeCKS信号通路来降低流感病毒所致PMVEC通透性的升高。XDY是否还能通过ERM及其上游信号通路起作用,目前尚不清楚。研究目的本课题针对上述两个问题进行了研究,探讨了 ERM相关信号通路在流感病毒致PMVEC通透性升高中的作用,同时观察XDY对流感病毒致PMVEC通透性升高中ERM相关信号通路的影响。研究方法1第一部分1.1流感病毒对PMVEC通透性的影响:100TCID50的流感病毒鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)作用于transwell小室构建的大鼠PMVEC后2h、6h、12h、24h、28h、32h,以跨内皮细胞单层电阻(TER)检测PMVEC单层通透性。1.2流感病毒对PMVEC骨架蛋白F-actin的影响:流感病毒感染PMVEC后24h,激光共聚焦显微镜观察骨架F-actin和流式细胞仪检测F-actin表达。1.3流感病毒对PMVEC中磷酸化ERM(p-ERM)的影响:流感病毒感染PMVEC后24h,Western blot检测PMVEC中p-ERM的含量;激光共聚焦检测PMVEC内p-ERM分布。1.4流感病毒对PMVEC中p38MAPK、Rho/ROCK、PKC通路的影响:流感病毒感染PMVEC后24h,Western blot检测PMVEC内磷酸化p38MAPK(p-p38)、磷酸化MKK(p-MKK)、ROCK水平,PKC活性试剂盒检测PMVEC内PKC的活性。1.5 MTT法检测p38MAPK通路抑制剂(SB203580)、Rho/ROCK通路抑制剂(Y27632)、PKC通路抑制剂(LY317615)对PMVEC的最大无毒浓度。1.6 p38MAPK、Rho/ROCK、PKC通路在病毒致PMVEC通透性和F-actin改变中的作用:用最大无毒浓度的SB203580、Y27632、LY317615孵育PMVEC2h后,再用流感病毒感染PMVEC,TER法检测PMVEC通透性;激光共聚焦检测F-actin分布;流式细胞术检测F-actin含量。1.7 p38MAPK、Rho/ROCK、PKC通路在病毒致PMVEC中p-ERM改变中的作用:用最大无毒浓度的SB203580、Y27632、LY317615孵育PMVEC2h后,再用流感病毒感染PMVEC。病毒作用24h后,Western blot检测PMVEC内p-ERM水平;激光共聚焦显微镜检测PMVEC内p-ERM分布。2第二部分2.1 XDY含药血清的制备:制备临床等效剂量的XDY含药血清,MTT法测定浓度分别为5%、10%、20%的XDY含药血清对PMVEC的毒性。2.2 XDY含药血清对流感病毒致PMVEC通透性变化的影响:流感病毒作用于PMVEC后,予以浓度为20%的XDY含药血清,用药后2h、6h、12h、24h、28h、32h,TER法检测PMVEC通透性。2.3 XDY含药血清对流感病毒致PMVEC中F-actin变化的影响:流感病毒作用于PMVEC后,予以浓度为20%的XDY含药血清,用药后24h,激光共聚焦显微镜检测F-actin的定位;流式细胞仪检测F-actin含量。2.4 XDY含药血清对流感病毒致PMVEC中p-ERM变化的影响:流感病毒作用于PMVEC后,予以浓度为20%的XDY含药血清,用药后24h,Western blot检测PMVEC中p-ERM水平;激光共聚焦显微镜检测p-ERM分布。2.5 XDY含药血清对流感病毒致PMVEC中ERM相关信号通路变化的影响:流感病毒作用于PMVEC后,予以浓度为20%的XDY含药血清,用药后24h,Western blot检测PMVEC中p-p38、p-MKK、ROCK水平;PKC活性试剂盒检测PMVEC中PKC活性。研究结果1第一部分1.1流感病毒作用于PMVEC6h后,PMVEC通透性开始升高;作用于PMVEC24h后,PMVEC通透性升至最高。1.2流感病毒作用于PMVEC 24h后,激光共聚焦显微镜结果表明,F-actin由胞膜向胞质聚集成束状、形成应力纤维;流式细胞仪检测结果表明,与正常组相比,病毒组F-actin表达增加,且有显著性差异(P<0.001)。1.3流感病毒作用于PMVEC后24h,Western blot结果表明,与正常组相比,病毒组p-ERM表达增加,且有显著性差异(P<0.01);激光共聚焦结果表明,与正常组相比,病毒组p-ERM在胞膜和胞质中表达均增加。1.4流感病毒作用于PMVEC后24h,Western blot结果表明,与正常组相比,病毒组p-p3 8、p-MKK、ROCK表达均增加,有显著性差异(尸<0.01;P<0.05;P<0.001)。与正常组相比,病毒组PKC活性明显增高,且有显著性差异(P<0.01)。1.5 SB203580、Y27632、LY317615能抑制流感病毒所致PMVEC通透性的升高,F-actin的重构和含量的升高。1.6 SB203580、Y27632、LY317615 孵育 PMVEC 后,再予流感病毒刺激,Western blot结果表明,与病毒组相比,SB203580组、Y27632组、LY317615组p-ERM均减少,但无统计学差异。2第二部分2.1 5%、10%、20%浓度的XDY含药血清对PMVEC均无毒细胞性。2.2流感病毒感染PMVEC后,予以XDY含药血清;TER法检测通透性,结果显示,XDY含药血清作用后6h、12h、24h、28h、32h,XDY含药血清组TER升高,与病毒组相比,有显著性差异(P<0.001)。2.3流感病毒感染PMVEC后,予以XDY含药血清;激光共聚焦显微镜显示,XDY含药血清作用后24h,能减轻流感病毒所致F-actin的重构,具体表现为大量粗大束状应力纤维的减少;流式细胞术结果显示,XDY含药血清组F-actin表达下降,与病毒组相比,有显著性差异(P<0.05)。2.4流感病毒感染PMVEC后,予以XDY含药血清;Western blot结果显示,XDY含药血清作用后24h,p-ERM表达下降。与病毒组相比,有显著性差异(P<0.05)。激光共聚焦显微镜显示,XDY含药血清作用后24h,p-ERM表达下降。2.5流感病毒感染PMVEC后,予以XDY含药血清;Western blot结果显示,XDY含药血清作用后24h,p-p38、p-MKK、ROCK1表达下降。与病毒组相比,p-p38、ROCK1水平有显著性差异(P<0.001;P<0.001)。XDY含药血清组PKC活性下降,与病毒组相比,有显著性差异(P<0.01)。研究结论1流感病毒可通过活化p38MAPK、Rho/ROCK和PKC信号通路促使ERM蛋白磷酸化,加强了 ERM蛋白与F-actin间的相互作用,使F-actin向胞质聚集、形成大量应力纤维,导致PMVEC收缩、PMVEC通透性的升高。2 XDY可通过抑制p38MAPK、Rho/ROCK和PKC信号通路的活化,减少ERM蛋白磷酸化、抑制F-actin重构,从而改善流感病毒所致PMVEC通透性的升高。