研究背景： 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜的慢性进展性炎症为特征，并可出现关节破坏、畸形，最终导致关节功能丧失。由于RA的发病机制尚未完全清楚，至今仍无根治的方法。目前认为炎症细胞因子和新生血管生成在RA的发病机制中扮演着重要角色。大量临床和实验研究提示，抑制炎症细胞因子和阻断新生血管过度形成是RA治疗的有效手段。 青蒿琥酯(artesuante，ART)是青蒿素的一种衍生物。近年青蒿素及其衍生物已成为治疗重症及氯喹抵抗型疟疾最为安全和有效的药物。近年越来越多的证据表明，除了抗疟作用外，这些复合物亦具有免疫调节以及抗炎、抗新生血管生成的潜在作用。但青蒿琥酯对RA的治疗作用及其机制目前尚不清楚，为此，本文拟通过选用wistar大鼠和RA患者原代成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesyoviocyte，FLS)为主要材料，以胶原诱导的关节炎(collagen-inducedarthritis，CIA)大鼠和TNF-α刺激成纤维滑膜细胞诱导炎症和VEGF表达为主要模型，采用免疫印迹、细胞免疫荧光、ELISA等。 研究方法：观察ART对CIA大鼠的治疗作用以及对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor’α，TNF-α)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的滑膜细胞炎症细胞因子分泌、炎症信号通路活化和VEGF表达的影响，以阐明ART对实验性类风湿关节炎的治疗作用及其分子机制，为今后临床上应用ART治疗类风湿关节炎提供实验依据和理论基础 第一部分青蒿琥酯对胶原诱导大鼠关节炎的治疗作用 目的:观察ART对胶原诱导的大鼠关节炎的临床症状、滑膜病理变化的改善作用 方法:25只体重70～90克的雄性Wistar大鼠，随机选取5只做正常对照，其余用牛Ⅱ型胶原乳剂造模。模型成功后随机分为两组，一组为ART组，腹腔注射100g/kg/d的ART，另一组为CIA模型组，注射等剂量的生理盐水。正常对照组大鼠处理同CIA模型组。观察三组大鼠一般情况、关节炎症指数(AI)积分、病理形态学改变和滑膜组织血管生成等情况。隔天记录大鼠关节炎指数评分；每周测体重，治疗两周后处死大鼠，用HE染色法观察各组踝关节病理形态血改变。 结果： 1、模型组大鼠精神欠佳，饮食减少，体毛无光泽，治疗组未见以上情况。模型组体重增长缓慢，治疗组大鼠体重增长较模型组明显，差异有显著性(p<0.05)。 2、CIA大鼠关节炎体征于注射胶原后11～13天开始出现，大鼠踝关节、跖趾关节发红、肿胀，并逐渐加重。与注射生理盐水的模型组比较，ART治疗组关节肿胀程度明显减轻，关节炎症指数也显著降低。 3、正常大鼠滑膜组织未见明显的新生血管及炎症细胞浸润，无滑膜增厚；模型组出现明显血管增生、滑膜增厚、水肿、大量炎症细胞浸润以及软骨和骨的明显破坏；ART治疗组可见少量新生血管及炎症细胞浸润，滑膜轻度增厚，未见软骨和骨质破坏。与模型组比较，治疗组滑膜病理评分和血管增生指数均显著降低(p<0.05)。 结论： 1、牛Ⅱ型胶原乳剂皮下注射wistar大鼠能成功复制CIA动物模型。 2、ART明显改善CIA大鼠临床症状、滑膜病理改变。 第二部分青蒿琥酯对人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞分泌炎症细胞因子及相关信号通路的影响。 目的：观察人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞中，青蒿琥酯对TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8合成的影响，并进一步研究这一复合物调控细胞因子分泌的细胞内信号机制。 方法： RA FLS来源于活动性RA患者，用TNF-α刺激并与青蒿琥酯共同孵育，ELISA测定IL-1β、IL-6及IL-8的水平，NF-κ B核移位用激光共聚焦显微镜检测，western blot用来检测信号转导蛋白表达和NF-κ B活性，用MTT法检测RA FLS活性。 结果： 1、用MTT法检测培养的RA FLS的细胞活性，在本实验所用药物浓度范围内(0.5-40 μ M)，青蒿琥酯不会降低细胞的存活率，提示本文观察到的青蒿琥酯的抑制作用不是毒性作用所致。 2、青蒿琥酯可抑制TNF-α刺激的RA FLS分泌IL-1β、IL-6和IL-8，并且呈剂量依赖性。同时青蒿琥酯亦抑制LPS诱导的RA滑膜细胞分泌TNFα，并呈剂量依赖性。 3、青蒿琥酯单独孵育并不影响p38 MAPK、ERK和JNK的磷酸化，而且对TNF-α诱导的这些激酶的活化也没有抑制作用。 4、青蒿琥酯对TNF-α诱导的P13K/Akt通路活性具有抑制作用，同时P13K特异性抑制剂LY294002明显抑制TNF-α诱导的FLS分泌IL-1β、IL-6及IL-8。 5、青蒿琥酯可阻止TNF-α诱导的NF-κ B p65核移位，且显著抑制NF-κB活化以及I κBα磷酸化和降解。 结论： 1、青蒿琥酯抑制RA患者FLS分泌炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8。 2、青蒿琥酯可能通过NF-κB和P13K/Akt通路抑制RA FLS中炎症细胞因子分泌，而与p38 MAPK、ERK和JNK等炎性信号通路无关。 第三部分青蒿琥酯对人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞VEGF合成和HIF-1α活化的影响。 目的：观察人类风湿关节炎(RA)成纤维细胞样滑膜细胞中，青蒿琥酯对TNF-α诱导的VEGF合成的抑制作用，并进一步探讨其细胞内信号分子机制。 方法： RA FLS来源于活动性RA患者，用TNF-α刺激并与青蒿琥酯共培养，Westernblot检测HIF-1α和VEGF的表达，HIF-1α的核移位用激光共聚焦显微镜检测。 结果： 1、TNF-α刺激可使FLS合成VEGF增高，并呈时间依赖性，于刺激24小时VEGF合成达最高峰。 2、青蒿琥酯显著抑制TNF-α诱导的VEGF合成，其最佳抑制浓度为10 μM3、TNF-α刺激FLS对HIF-1α蛋白表达无影响，但可诱导HIF-1α活化即由胞浆向胞核移位。 3、青蒿琥酯抑制TNF-α诱导的HIF-1α由胞浆向胞核移位。 结论： 青蒿琥酯对RA FLS中TNF-α诱导的VEGF合成具有抑制作用，其机制可能与其抑制HIF-1α活化有关。