神经胶质细胞瘤是成年人脑肿瘤中常见类型,年发病率为5/100000。根据世界卫生组织公布指南,胶质瘤主要分类为星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、室管膜瘤、混合性胶质瘤。根据肿瘤的恶性程度,神经胶质瘤分为I级(低增殖能力、低侵袭性)到IV级(高侵袭性、核分裂活跃、易坏死的胶质母细胞瘤)。90-95%的胶质母细胞瘤为原发性。髓母细胞瘤不在WHO此类分类中,它是是儿童脑肿瘤发病率最高的肿瘤之一,常起源于小脑。针对恶性胶质瘤,目前首选的治疗方法为最大限度的手术切除,并联合放疗和辅助性化疗等手段,但过去十年间其治疗预后效果的改善也是微乎其微。术后规范放化疗胶质瘤患者中位生存期约为1.8年。虽然国内外一直探索有效的治疗方法来改善胶质瘤的治疗效果,包括间质内放化疗、光动力学治疗以及免疫治疗等,但最终收效甚微,生存期与5年前统计的存活率(17-24%)相比进展不大。胶质瘤的基因变化和分子生物学一直是研究的重点内容。目前认为许多基因突变会引起胶质瘤细胞的生长、凋亡、迁移以及血管新生等变化。随着研究的不断深入,Notch信号通路在胶质瘤的发生和进展中所发挥的重要调节作用进入研究者的视线,科学家们对其进行了各方面的探索。哺乳动物基因组编码四个Notch同源基因(Notch1-4)。Nocth通路由五个配体激活(Deltex 1/3/4,Jagged1/2)组成,均属于膜蛋白。脊椎动物中多个Notch配体中与Deltex同源的配体称为Deltex或Deltex-like。Notch信号通路依据是否CSL依赖分为为CSL非依赖及CSL依赖两种途径。有研究证实,在CSL非依赖的Notch通路中,Deltex蛋白发挥了重要作用,Deltex-1是通过与Notch胞内段ANK重复序列结合,负向调节Notch信号,过表达Deltex-1会抑制Notch信号的作用。Nocth通路受体在胚胎发育和出生后发育过程中调节细胞分化活动。某些过表达的下游分子能上调该通路信号而促进间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向特定方向分化。另外,Notch通路通过维持神经干细胞功能和促进神经前体细胞进入胶质细胞谱系以阻止神经细胞分化。Nocth受体在胶质瘤中表达上调,其致瘤性已在体内外得到验证。本课题组的前期研究结果证实,Notch对于胶质瘤的血管新生有促进作用。本研究拟在GCBI(Gene-Cloud Biotechnology Information)平台筛选神经胶质细胞瘤中Notch信号通路激活后基因变化,结合Gene Ontology和基因共表达网络分析筛选激活Notch通路的关键基因。结合前期工作基础,我们发现了关键基因ITGB1,通过在胶质瘤细胞内过表达和干扰差异基因的表达,观察对胶质瘤细胞增殖能力的影响,验证ITGB1与Notch通路的关系,进一步通过定量PCR和免疫组化技术,检测ITGB1在肿瘤标本与正常对照组之间的表达水平,分析差异表达与胶质瘤预后的关系。第一部分 生信数据分析脑胶质瘤细胞中Notch信号通路相关基因表达目的:筛选在激活Notch信号通路中具有关键作用的基因。方法:在GCBI数据库筛选芯片数据,选择芯片表达谱进行Pathway、Gene Ontology和基因共表达网络分析。结果:1、差异性基因表达谱:通过检索GCBI数据库获得GSE22772芯片数据,筛选出表达倍数变化>1.1倍的基因有7962条。2、信号通路显著性分析:干扰Deltex-1表达后,得到Deltex-1介导调节多个信号通路,本研究筛选最显著的10个信号通路。GO基因富集分析显示,Deltex-1功能多样,调控细胞凋亡、细胞周期、信号转导等,本研究筛选出10个相关性最强的基因功能进行生物信息学分析。3、对差异基因表达谱、显著性基因功能和显著性信号通路取交集,找到既参与了显著功能又参与了显著信号通路的靶基因ITGB1,构建其与其他靶基因之间的关系网络。结论:在GSE22772表达谱中筛选出差异性表达基因,通过GO分析和基因共表达网络分析,发现ITGB1可能在激活Notch信号通路中具有重要作用。第二部分 ITGB1在胶质瘤组织中的表达及与患者预后的关系目的:在胶质瘤标本和瘤周正常组织检测ITGB1的表达水平;分析ITGB1与胶质瘤病理分级的关系;分析ITGB1的表达与预后的关系。方法:1、利用实时荧光定量PCR及免疫组化分别检测ITGB1在临床胶质瘤肿瘤组织和瘤周正常组织中的m RNA和蛋白的表达水平;2、回顾病例并随访,利用Kaplan-Meier曲线分析ITGB1在的表达差异与胶质瘤患者预后的关系。结果:1、ITGB1 m RNA在24对胶质瘤组织标本中平均表达水平高于瘤周正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果同q RT-PCR结果一致,ITGB1蛋白在肿瘤组织中表达量显著高于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、通过筛选并随访43例患者,发现低表达ITGB1的患者生存时间较长,高表达ITGB1的患者生存时间较短,ITGB1和胶质瘤的预后呈负相关。结论:ITGB1在胶质瘤组织中显著高表达,并且与患者的生存时间呈负相关,可作为预测患者预后的潜在生物标记物,指导临床诊疗工作。第三部分 ITGB1对脑胶质瘤细胞增殖行为的影响及与Notch信号通路之间的关系目的:探讨ITGB1对胶质瘤细胞的增殖行为的影响及其与Notch信号通路之间的关系。方法:1、利用实时荧光定量PCR检测胶质瘤细胞株(U251、SHG44、U373、U87、T98G)中ITGB1的m RNA表达水平,选取表达水平最低和最高的细胞株进行后续实验;2、利用慢病毒在U87细胞株中转染sh-ITGB1质粒以干扰ITGB1表达,在U251细胞株中转染oe-ITGB1质粒以过表达ITGB1;3、干扰和过表达ITGB1后,利用MTT实验检测胶质瘤细胞的增殖能力变化;4、干扰和过表达ITGB1后,利用克隆形成实验检测胶质瘤细胞的克隆形成能力变化;5、干扰和过表达ITGB1后,利用Western blot检测Notch及其通路下游蛋白Hey1蛋白表达水平变化,进一步探索ITGB1与Notch通路的关系。结果:1、ITGB1在五种胶质瘤细胞株中均有m RNA表达,其中U87细胞株中ITGB1的m RNA表达量最高,U251细胞株中ITGB1的m RNA表达量最低。在后续实验中,选择U87进行干扰ITGB1的表达,选择U251进行ITGB1的过表达。2、在U87细胞株中转染sh-ITGB1,U251转染oe-ITGB1后,荧光显微镜观察到shITGB1和oe-ITGB1在U87、U251中转染效率良好。q RT-PCR及Western blot检测ITGB1在分别在U251、U87细胞中的m RNA及蛋白成功过表达或被干扰;验证ITGB1蛋白在U251中表达量上调(P<0.05)、U87细胞表达量显著下调(P<0.05),结果具有统计学差异。3、MTT实验显示干扰ITGB1后,显著抑制U87的增殖能力,过表达ITGB1后,显著促进U251的增殖能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、克隆形成实验显示干扰ITGB1后,显著抑制U87的克隆形成能力,过表达ITGB1后,显著促进U251的克隆形成能力,差异具有统计学意义(P<0.05)。5、ITGB1下调后,Nocth蛋白和Hey1蛋白表达也出现显著下调(P<0.05);过表达ITGB1则显著上调了Notch蛋白(P<0.05)和Hey1蛋白(P<0.05)。结论:ITGB1能显著促进胶质瘤细胞增殖与克隆形成能力。且ITGB1与Notch信号通路可形成反馈调节机制。