牙周炎由细菌菌斑引起,表现为炎症反应,该疾病的特征在于结缔组织的分解和牙槽骨的吸收,牙周支持组织丧失,最终可导致牙齿脱落,但其确切的发病机制还没有充分揭示。前期研究提示牙周炎和炎症性破坏及免疫反应显著相关。牙周炎是一个炎症性疾病,硬组织破坏和软组织破坏可能由一些生理和病理因子如炎性细胞因子、活性氧化合物和前列腺素等的合成和释放所调节。目前为止,在牙周炎进展过程中,软组织炎症的发生发展和硬组织从脱矿(骨密度下降)到崩塌在时间上具体的先后伴行关系还不清楚。骨吸收和软组织破坏是牙周炎主要的病理表现。基质金属蛋白酶MMPs以降解细胞外基质和基底膜成分为主。MMP-2和MMP-9和牙周组织的破坏密切相关,在牙周炎进程中起到重要作用。诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)在炎症位点过度表达,对血管扩张、免疫应答和骨吸收等方面有多样效应。一氧化氮NO和前列腺素PGE2均参与免疫炎性反应,介导结缔组织破坏和骨吸收。OPG/RANK/RANKL系统充分介导骨代谢过程,由多种组织和细胞产生,并受其他的细胞因子影响,进一步直接或间接参与骨代谢过程。电子显微探针EPMA是具有高灵敏度的无损检测方法,并可同时对被测物品中的多个元素同时进行检测分析,因此可以在分析牙周病变过程中,用于精确检测骨中元素。芍药苷具有抗炎,抗氧化等多种免疫调节活性。提示其可能作为一个潜在的应用于牙周炎的抗炎药物。然而,之前并没有芍药苷对牙周炎中牙槽骨和软组织破坏进行保护作用的相关研究。因此,其能否在牙周炎进程中发挥抗炎和免疫调节特性有待深入研究。基于牙周软硬组织破坏在牙周炎中进程不同及伴行关系,以及对芍药苷作用于宿主参与炎症调控的潜在机制探索,设计本研究。本研究通过对丝线结扎的大鼠实验性牙周炎模型进行中期干预,阻断牙周炎症进程,观察牙周炎不同时相软硬组织的炎症进展和伴行关系。同时通过对牙周炎动物施加不同剂量的芍药苷进行保护,观测其在牙周炎进程中是否起到延缓牙周炎进程,保护牙周组织的作用,并观测其是否与MMP-2,MMP-9,iNOS和COX-2的调节有关。实验一 丝线结扎诱导大鼠牙周炎模型的建立及牙周组织破坏程度和MMP-2, MMP-9,iNOS和COX-2的蛋白水平表达目的：建立丝线结扎诱导的大鼠牙周炎模型,并观察健康对照组和牙周炎组中MMP-2,MMP-9,iNOS和COX-2的蛋白水平表达。材料和方法：选用成年雄性Wistar大鼠14只,随机分为2组,每组7只。在大鼠下颌第一磨牙牙颈部放置丝线结扎诱导实验性牙周炎形成。于第7天处死动物,采用微型计算机断层扫描评价骨吸收程度。组织学分析和天狼猩红染色评估软组织破坏和胶原纤维的降解。免疫印迹检测(western blotting)牙龈中MMP-2,MMP-9, iNOS和COX-2的表达水平。结果：在健康对照组牙周组织保持健康,在牙周炎组可见牙槽骨水平明显减少,并可观察到明显的软组织炎症。牙周炎组其牙周组织中炎性因子MMP-2,MMP-9, iNOS和COX-2表达水平明显增加。结论：丝线结扎诱导的大鼠实验性牙周炎模型,可造成牙周组织急性炎症反应和牙槽骨吸收。实验二 牙周炎进程中软硬组织破坏伴行关系分析背景和目的：中期干预结扎的大鼠牙周病模型,观察在牙周炎进展及恢复过程中,软组织炎症与硬组织破坏程度在时相上的先后及伴行关系。材料和方法：丝线结扎大鼠诱发牙周病,并于0,1,3,5,7,9,11天处死。HE染色(hematoxylin and eosin stain)观察软组织炎症及牙槽骨破坏程度,Micro-computed tomography (Micro-CT)和电子显微探针Electron probe microanalysis(EMPA)检测牙槽骨局部脱矿程度、深度和最终崩塌的时间关系,reverse transcription-PCR (RT-PCR)检测牙周病进展及修复过程中软硬组织内RANKL和OPG等基因的变化。结果：HE染色显示,丝线结扎后,软组织炎症即刻发生,硬组织破坏稍晚于软组织,中期干预去除丝线后,软组织炎症消退,硬组织破坏随即停止。Micro-CT显示同样时相。EMPA检测同样进程,可见硬组织由表层起迅速脱矿崩塌,脱矿范围超过301μm深处后不明显,差异无显著性(p>0.05)。软组织炎症停止后,硬组织停止脱矿且密度迅速回升。RT-PCR结果表明,软组织中RANKL与OPG基因mRNA转录及RANKL/OPG比值变化不大,差异无显著性(p>0.05)。硬组织中RANKL基因mRNA转录于软组织炎症发生后迅速升高,炎症终止后即刻下降,OPG变化较小,时相与RANKL同步,RANKL/OPG比值于炎症开始逐步增高,随炎症终止迅速下降。结论：牙周炎进程中,硬组织脱矿晚于软组织炎症发生,干预终止软组织炎症后’硬组织脱矿随即停止。提示牙周炎复查周期宜小于硬组织破坏所需周期,始终维持软组织健康,可能避免牙槽骨进一步丧失。实验三芍药苷对丝线结扎诱导大鼠牙周炎模型中软硬组织保护作用的研究背景与目的：芍药苷是中药芍药类植物的主要有效成分,据报道具有明显的抗炎和免疫调节活性。本研究旨在研究芍药苷对实验性牙周炎中牙槽骨的破坏和软组织破坏降解的保护作用。评估了MMP-2,MMP-9,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)在芍药苷的牙周炎保护活性中所发挥的作用。材料与方法：28只Wistar大鼠随机分为以下四组：健康对照组；牙周炎组；牙周炎加30毫克／公斤的芍药苷(P30)组；和牙周炎加60毫克／公斤的芍药苷(P60)组。于大鼠下颌第一磨牙放置丝线结扎诱导实验性牙周炎。于实验前后测量各大鼠的体重并记录。采用微型计算机断层扫描评价骨吸收程度。组织学分析和天狼猩红染色评估软组织破坏和胶原纤维的降解。免疫印迹检测(western blotting)检测牙龈中MMP-2,MMP-9,iNOS和COX-2的表达水平。结果：在健康对照组牙周组织保持健康,在牙周炎组可以观察到牙槽骨水平明显减少,并可观察到明显的软组织炎症。芍药苷以剂量依赖方式显著抑制牙槽骨丧失和炎性浸润。P30和P60组中胶原纤维含量明显高于牙周炎组。Western印迹分析的结果显示,加入30和60毫克／公斤芍药苷的两组都能显著下调MMP-2,MMP-9,iNOS和COX-2表达水平。结论：本研究首次证实芍药苷能显著下调炎性浸润,并抑制牙槽骨丧失和软组织炎症破坏。芍药苷的抗炎机制可能通过其对MMP-2,MMP-9,iNOS和COX-2的抑制作用得到体现。