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研究背景病毒是一类极具感染性的微生物,严格寄生于宿主细胞中,以复制的方式进行繁殖。病毒感染严重威胁人类健康,诱发机体炎症反应、感染组织的病理损伤、功能异常,甚至死亡,已成为世界公共卫生安全的巨大隐患之一。巨噬细胞是机体固有免疫系统的重要组成部分,在固有免疫免疫应答中发挥至关重要的作用,构成人体抵抗病原体感染的第一道防线。一方面,病毒入侵机体时巨噬细胞作为专职吞噬细胞,能够通过其吞噬作用摄取病毒粒子或被感染细胞,发挥直接清除病毒或抗原提呈作用,启动适应性免疫应答;另一方面,巨噬细胞表面表达的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）,可识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,介导Ⅰ型干扰素转录激活,进而发挥先天免疫抗病毒效应。巨噬细胞中的能量代谢稳态对维持其生命活动至关重要,其中糖酵解代谢通路的激活有利于其抗病毒反应。然而,过度增强的糖酵解代谢又可介导病毒在巨噬细胞中的大量复制、实现免疫逃逸。因此,进一步揭示病毒诱导宿主细胞代谢重编程的机制,有望为新型病毒治疗提供新的靶点。肿瘤坏死因子诱导的蛋白8样分子1（Tumor necrosis factor-induced protein 8-like 1,TIPE1）属于TIPE家族成员,主要定位于胞浆、通过与多种蛋白相互作用、影响相关信号通路活化,进而调控众多生物学过程（如:细胞死亡、增殖、迁移、脂质代谢等）,参与肿瘤、非酒精性脂肪肝、糖尿病肾病等多种疾病的发生发展进程。同时,TIPE1高表达于免疫细胞,参与免疫调节。本课题组前期的研究发现,TIPE1通过结合并调控PIP2/PIP3代谢,促进巨噬细胞M2极化,加速肿瘤进程。另有研究报道,脓毒症模型中,TIPE1通过影响树突状细胞（DC）细胞的成熟、抑制脓毒症的发展。然而,TIPE1在病毒感染疾病中的作用和调控机制尚未有相关报道。研究目的1.研究TIPE1对巨噬细胞中病毒复制的影响。2.探究TIPE1调控巨噬细胞中病毒复制的作用机制。研究方法1.病毒感染下调TIPE1表达为初步分析TIPE1在病毒复制和抗病毒免疫中的可能作用,我们首先检测了病毒感染巨噬细胞中TIPE1表达情况。以水疱性口炎病毒（VSV）、以仙台病毒（SeV）和单纯疱疹病毒（HSV-1）感染C57BL/6小鼠的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）,RT-qPCR和/或Western blot结果显示,病毒感染能够下调BMDMs中TIPE1表达。相类似地,VSV和SeV病毒感染亦可下调人肺癌细胞系A549细胞中TIPE1的表达。上述结果显示,病毒感染能够调控细胞中TIPE1表达,提示其可能参与调控病毒复制。2.TIPE1抑制病毒复制为研究TIPE1对病毒复制的影响,我们构建了Tipe1flox/flox小鼠和Lyz-Cre+;Tipe1flox/flox小鼠,分离BMDMs细胞,以VSV、SeV、HSV-1病毒感染,RT-qPCR结果显示,Tipe1基因敲除BMDMs中VSV、SeV、HSV-1病毒RNA水平均明显高于WT BMDMs细胞。相反地,以TIPE1过表达质粒（pcTIPE1）或空载对照质粒（pcDNA3）转染RAW264.7细胞,以VSV、SeV、HSV-1病毒感染,RT-qPCR和Western Blot显示Tipe1过表达细胞中病毒RNA/蛋白水平显著降低。上述结果提示,TIPE1表达负向调控巨噬细胞中病毒复制。为进一步验证TIPE1在病毒复制及所致感染损伤中的作用,分别给予Tipe1flox/flox小鼠和Lyz-Cre+;Tipe1flox/flox小鼠腹腔注射VSV病毒,检测肝脏和肺脏组织中病理损伤和病毒复制指标。通过HE染色、RT-qPCR和Western Blot结果证明:髓系细胞特异性Tipe1基因敲除可促进肝、肺组织中病毒复制,加重组织病理损伤。此外,将TIPE1过表达质粒pcTIPE1或pcDNA3对照质粒转染肺癌细胞系A549,以VSV或SeV病毒感染,RT-qPCR结果显示:TIPE1过表达后明显降低了 A549细胞内病毒RNA水平。上述结果表明,TIPE1能够在体内外抑制病毒复制。3.TIPE1以不依赖于Ⅰ型IFN的途径抑制病毒复制鉴于Ⅰ型IFN通路在抗病毒反应中的重要作用,我们首先分析了 TIPE1是否以Ⅰ型IFN依赖的方式影响病毒复制。以VSV、SeV、HSV-1病毒感染Tipe1flox/flox和Lyz-Cre+;Tipe1flox/flox小鼠来源的BMDMs,RT-qPCR、ELISA结果显示:Tipe1基因缺失可显著上调病毒感染BMDMs中Ifnb mRNA和IFN-β蛋白的水平,Western blot显示Tipe1基因缺失亦上调IRF3磷酸化水平。相一致地,TIPE1过表达能够下调病毒感染的RAW264.7细胞中Ifnb mRNA、IFN-β蛋白水平以及IRF3磷酸化水平。上述结果,TIPE1抑制病毒复制水平的同时,下调巨噬细胞中IFN-β的表达。为了验证TIPE1调控病毒复制和IFN-β产生之间的关联性,TIPE1过表达或对照RAW264.7细胞以VSV或SeV病毒感染的同时,加以Ⅰ型干扰素受体抑制剂（IFNAR-IN）处理,RT-qPCR结果显示IFNAR抑制剂处理能够显著上调对照组细胞中VSV或SeV mRNA水平,没有消除TIPE1过表达对病毒复制的影响。上述结果提示,TIPE1抑制病毒复制的作用不依赖Ⅰ型IFN途径。4.TIPE1调控HIF-1α通路抑制巨噬细胞中病毒复制为进一步探究TIPE1抑制病毒复制的作用机制,我们提取了Tipe1flox/flox小鼠和Lyz-Cre+;Tipe1flox/flox小鼠的BMDMs,以VSV病毒感染,RNA-seq筛选差异表达基因,Tipe1基因敲除BMDMs中HIF-1α表达明显升高。KEGG和GSEA分析结果显示,Tipe1基因敲除BMDMs中HIF-1信号通路显著富集。RT-qPCR进一步证实,VSV、SeV、HSV-1病毒感染的Tipe1基因缺失BMDMs中HIF-1α mRNA/蛋白水平显著高于WT BMDMs。为证实HIF-1α通路在TIPE1调控病毒复制中的作用,分别以氯化钴（CoCl2）处理细胞诱导缺氧环境、上调HIF-1α表达或利用抑制剂BAY-87抑制HIF-1α通路活化。结果显示,氯化钴处理能够增强BMDMs中Hif-1amRNA表达水平,同时上调VSV mRNA水平,且消除Tipe1基因缺失对病毒复制的促进作用。相一致地,BAY-87明显降低BMDMs中VSV mRNA水平,同时消除了Tipe1基因缺失对病毒复制的影响。上述结果证明:病毒感染时,Tipe1基因缺失通过上调HIF-1α表达,促进病毒复制。5.TIPE1干扰巨噬细胞中HIF-1α/糖酵解通路抑制病毒复制已有研究证实,HIF-1α通路在调控细胞代谢中发挥关键作用,且上述RNA-seq数据经KEGG分析显示Tipe1基因敲除BMDMs细胞中糖酵解代谢通路明显富集,而Seahorse实验证实Tipe1基因敲除的BMDMs细胞中糖酵解速率、培养上清中乳酸含量明显显著高于对照BMDMs细胞。为进一步验证TIPE1是否通过HIF-1α/糖酵解通路抑制病毒复制,我们检测了 HIF-1α抑制剂BAY-87对病毒感染BMDMs细胞培养上清中的乳酸含量。结果发现,BAY-87处理显著降低了 BMDMs细胞培养上清中乳酸水平,且消除了Tipe 1flox/flox和Lyz-Cre+;Tipe 1flox/flox两组BMDMs细胞培养上清中乳酸含量的差异。更为重要地,糖酵解抑制剂2-DG处理能够显著抑制BMDMs中VSV mRNA水平,且消除了Tipe1基因敲除对病毒复制的影响。上述结果提示,TIPE1可能通过下调HIF-1α表达、抑制糖酵解通路,进而降低病毒复制水平。6.筛选介导TIPE1调控HIF-1α/糖酵解通路的候选相互作用蛋白研究报道,TIPE1可以通过与胞内多种分子相互作用、调控信号通路及细胞生物学行为。为初步探讨TIPE1调控HIF-1α/糖酵解通路的分子机制,进一步利用免疫沉淀（IP）联合质谱分析（LC-MS/MS）筛选TIPE1相互作用蛋白。质谱结果显示,丙酮酸激酶（PKM）与TIPE1蛋白存在潜在的相互作用。CO-IP实验显示,PKM2与TIPE1存在相互作用,且在VSV感染后进一步增强。已有研究显示,PKM2能够促进HIF-1α基因的转录激活。因此,我们推测TIPE1可能与PKM2相互作用调控HIF-1α/糖酵解通路。利用PKM2抑制剂进行验证,RT-qPCR结果证明,PKM2抑制剂明显消除TIPE1对BMDMs中病毒复制的影响。上述结果证明病毒感染时TIPE1通过与PKM2相互作用增强,抑制病毒复制。研究结论1.病毒感染能够下调细胞中TIPE1表达。2.TIPE1能够以非依赖Ⅰ型IFN通路的方式抑制病毒复制。3.TIPE1通过干扰HIF-1α/糖酵解代谢进而抑制病毒复制。创新性及意义1.首次揭示了病毒感染下调细胞中TIPE1表达,可能是介导病毒逃逸的机制之一。2.证明了 TIPE1通过重编程巨噬细胞中HIF-1α/糖酵解通路,阻止病毒逃逸。3.本课题的研究为阐明病毒复制的调控机制提供了新的理论依据,为研发新型抗病毒药物和预防治疗手段提供可能的靶点和思路。