动脉粥样硬化(AS)易损斑块作为所有心脑血管疾病的共同病理基础,为冠心病、脑梗死及外周血管病的主要诱因,其进一步累及心脏而引起的冠状AS性心脏病排名全球死亡原因中的首位。针对易损斑块形成及破裂机制,研发有效治疗药物及方法,促使斑块向稳定方向转变,不仅是预防AS及继发疾病的重要方法,而且是国内外心血管学界面临的重点课题。“降脂化痰、扶正化瘀”为中医目前治疗AS斑块的主要治则之一。硫酸多糖在免疫调节和抗凝血方面具有的显著作用,满足了 AS斑块“降脂化痰、扶正化瘀”治疗的功效和理论需求。其已在AS斑块防治方面显示出巨大潜能。水产动物所处的特殊环境造就了其多糖高硫酸基含量的结构基础,其为目前天然硫酸多糖获取的主要来源之一。田螺为圆田螺属一种贝类软体动物。田螺肉自古就是我国城乡居民十分喜欢的一种美味佳肴,同时还是历代医家的一味除疾良药。作为一种习见的药食同源水产动物,其生长环境满足了其体内硫酸多糖合成的天然条件。因此,基于该资源,制备开发硫酸多糖,并深入研究该硫酸多糖对AS斑块的作用及机制,是一个非常有理论价值和现实意义的课题。目的:本课题旨在通过对田螺硫酸多糖(Sulfated polysaccharides from Cipangopaludina chinensis,CCPSs)提取、蛋白脱除、分级纯化等工艺的优化研究,构建CCPSs的系统制备方法;系统鉴定解析出CCPSs的理化性质和一级结构,奠定其质量控制、药效评价及构效关系研究的基础;全面考察CCPSs对动脉硬化指数(Arteriosclerosis index,AI)和易损指数(Vulnerable index,VI)的影响,评价CCPSs抗AS及稳定斑块的作用效果;综合研究CCPSs对AS斑块内血管新生及其调控的PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响,阐明CCPSs稳定AS斑块的机制。从而形成CCPSs“制备-结构-功效-机制”四维立体系统研究成果,为CCPSs的综合开发与利用提供理论支持。方法:1.CCPSs提取、蛋白脱除、分级纯化的工艺研究采用超声耦合酶解辅助提取法来提取CCPSs粗多糖,并运用单因素实验设计和响应面实验设计对超声耦合酶解辅助提取CCPSs粗多糖的工艺条件进行优化,并通过与传统热水提取法进行对比,构建基于超声耦合酶解辅助技术的CCPSs粗多糖提取新方法。在此基础上,利用循环冻融技术(Freezing-thawing cyclic treatment,FTT)对CCPSs粗多糖提取液中的蛋白进行脱除,并使用单因素实验设计来对提取工艺参数条件进行优化筛选,通过与传统Sevag法对比而建立基于FTT技术的CCPSs粗多糖提取液中蛋白绿色脱除新方法。最后,采用Q Sepharose Fast Flow柱色谱和Sephacryl S-400凝胶柱色谱联合的方法对CCPSs粗多糖进行分级纯化,以硫酸基含量和分子量均一度为筛选指标,对分离组分进行跟踪筛选与优化,得到目标纯化多糖组分CCPSs。2.CCPSs理化性质及结构鉴定研究应用直观观察法评价外观,静态平衡溶解度测定法测试溶解度,苯酚硫酸法测量总糖含量,考马斯亮蓝法测量蛋白质含量,离子色谱法测量硫酸基含量,硫酸-间羟联苯法糖醛酸含量,UV-vis光谱识别蛋白和核酸存在情况,IR光谱鉴定官能团及糖环存在形式,多糖水解的糖腈乙酸酯衍生物-GC光谱法分析确定单糖组成及比例,分子排阻高效液相色谱法确定分子量及均质性,高碘酸氧化和Smith降解以及甲基化反应-气相色谱分析羟基取代情况及糖苷键连接位点,ID和2D NMR波谱分析鉴定异头碳构型、羟基取代情况及糖基链接次序。在此基础上,进行综合波谱分析鉴定CCPSs一级结构。3.CCPSs稳定AS斑块的作用研究利用高脂饲料喂养的载脂蛋白E基因敲除(Lacking the murine apolipoprotein E,ApoE-/-)小鼠复制AS模型。采用试剂盒测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)等血脂含量,并以此为基础,计算AI值。运用苏木素-伊红(H&E)染色法观察斑块形态、测定斑块组织及管腔面积,并计算斑块组织与管腔的面积之比。使用天狼猩红染色法测定胶原含量,油红O染色法测定斑块内脂质含量;α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD68抗体对平滑肌细胞及巨噬细胞进行免疫荧光染色后测定其各自含量,并以这些研究为基础,计算斑块的VI值。通过比较各组斑块与管腔的面积比、AI值及VI值来评价CCPSs抗AS及稳定斑块的作用效果。4.CCPSs稳定AS斑块的作用机制研究采用体内与体外实验相结合的方法。以高脂饲料喂养的ApoE-/小鼠-AS模型为对象,利用CD34抗体来进行免疫荧光染色测定斑块内新生血管密度,论证CCPSs对斑块内血管新生的影响。并应用Western Blot及qRT-PCR技术检测动脉斑块内PI3K/Akt/mTOR通路信号分子及下游促血管新生关键因子的mRNA及蛋白表达情况,论证CCPSs对斑块内血管新生调控的PI3K/Akt/mTOR信号通路影响。在此基础上,以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,通过联合通路激动剂和阻断剂,从正、反两方面进一步论证CCPSs抑制血管新生与PI3K/Akt/mTOR通路调控之间的关系。成果:1.CCPSs提取、蛋白脱除、分级纯化工艺研究(1)超声耦合酶解辅助提取法对CCPSs粗多糖提取的最佳工艺条件为:液料比(mL:g)为22.5:1、酶用量为238 U/g、pH值为5.0、提取温度58℃、超声功率为400 W。在优化的条件下,CCPSs提取率达13.57±0.48%。相对于传统的热水提取法,利用本方法来提取CCPSs,不仅能节省时间、降低溶剂消耗和能耗,而且能得到更高的CCPSs粗多糖得率,多糖含量和提取率。(2)FTT脱除CCPSs粗多糖提取液中蛋白的最佳工艺为:冷冻温度为-40℃、冷冻时间为96h、解冻温度为10℃、冻融循环处理次数为11次。在该最佳工艺参数条件下,FTT法对CCPSs粗多糖提取液中蛋白脱除率(Dr%)、多糖保留率(Rr%)、多糖与蛋白的选择系数(Kc)分别为87.10± 1.91%、84.91±2.45%、5.77±0.43。相对于传统Sevag法,FTT法不仅具有高蛋白脱除率和维持多糖结构稳定等优点,而且还有高选择性和绿色无污染的特点。(3)CCPSs 粗多糖经 Q Sepharose Fast Flow 柱色谱和 Sephacryl S-400 凝胶柱色谱的联合分级纯化,通过组分筛选和优化,获得了离子电性和分子量均较均一的目标多糖CCPSs,且其平均产率达1.42%。2.CCPSs理化性质及结构鉴定研究CCPSs为易溶于水的白色粉末物,平均总糖含量为91.88%,不含蛋白和糖醛酸。CCPSs是由D-Glc组成的均多糖,它的平均分子量为91.1 kDa。CCPSs的主链由(1→3)链接的α-D-Glc组成。分支链由一个(1→3)链接的α-D-Glc和末端α-D-Glc-4-O-S03-组成。其分支链连接于主链α-D-Glc的C-4上。CCPSs结构的分支度为16.73%。其支链中α-D-Glc-4-O-SO3-的C-1通过(1→3)链接的O-3连接到α-D-Glc上。该多糖的平均硫酸基含量为9.12%。3.CCPSs稳定AS斑块的作用研究CCPSs对AS斑块具有显著稳定作用。其对斑块的稳定作用主要表现为:CCPSs能明显降低模型小鼠血清中TC、TG、LDL含量(P<0.01或P<0.05),并显著升高HDL含量(P<0.01);明显缩小斑块面积(P<0.01);显著抑制斑块组织内脂质含量和巨噬细胞含量(P<0.01或P<0.05),并明显升高平滑肌细胞含量和胶原含量(P<0.01或P<0.05)。通过有效改善AS模型小鼠的血脂代谢紊乱而显著减小AI指数(P<0.01),并显著抑制斑块易损成分和促进斑块维稳因子而明显降低VI值(P<0.01)。4.CCPSs稳定AS斑块的作用机制研究在ApoE-/-小鼠AS模型上,CCPSs能显著抑制AS模型小鼠主动脉斑块内的新生血管密度(P<0.01或P<0.05),并能明显抑制PI3K/Akt/mTOR通路信号分子及下游血管生成调节因子VEGF及MMP-9的mRNA及磷酸化蛋白表达(P<0.01或P<0.05)。在HUVECs细胞模型上,CCPSs不仅能显著抑制通路激动剂VEGF引起的PI3K/Akt/mTOR通路信号分子mRNA及磷酸化蛋白强表达,而其对VEGF诱发HUVECs的Matrigel胶高管腔形成率也有明显抑制作用(P<0.05)。且CCPSs的这种抑制作用能被通路阻断剂LY294002(PI3K的特异性通路阻断剂)所阻断。使用LY294002后再增加CCPSs干预,其对PI3K/Akt/mTOR通路信号分子mRNA和磷酸化蛋白表达以及HUVECs的Matrigel胶管腔形成率的影响,与单独使用LY294002之间的差异不具有统计意义(P>0.05)。结论:本文以田螺肉为原料,运用超声耦合酶解辅助提取法具有快速破胞和高效水解糖蛋白糖肽键的特点,通过提取方案设计和参数优化,建立起了基于超声同步耦合酶解法的CCPSs粗多糖提取新方法,并证明超声同步耦合酶解提取法为CCPSs粗多糖较为理想的提取方法;利用蛋白与多糖在FTT过程中溶解度的差异,通过蛋白脱除方案的设计和参数优化,构建了基于FTT技术的CCPSs粗多糖提取液中蛋白绿色脱除新方法,并证明FTT法作为一种环境友好型地绿色方法,其用于CCPSs粗多糖提取液中蛋白脱除能够替代传统的Sevag法;针对高硫酸基含量赋予CCPSs高负电性的特点,并结合多糖作为一类大分子聚合物的化学本质,形成了基于Q Sepharose Fast Flow柱色谱和Sephacryl S-400凝胶柱色谱的CCPSs粗多糖联合分级纯化方法,获得了离子电性和分子量均较为均一的目标多糖CCPSs;综合应用化学分析、UV-vis光谱、IR光谱及NMR波谱等现代分析技术,识别鉴定解析出了 CCPSs的理化性质和一级结构特征;通过体内和体外实验,论证了 CCPSs对AS斑块具有显著稳定作用,并阐明了 CCPSs基于PI3K/Akt/mTOR通路干预血管新生而稳定AS斑块的作用机制。通过这些创新性的研究,在理论上,提出和验证了“CCPSs具有稳定AS斑块作用,且其稳定机制是通过PI3K/Akt/mTOR通路介导的斑块内血管新生”的理论假说;在实验方法上,对CCPSs制备引入了新型冻融脱蛋白技术,超声辅助耦合酶法提取方法和Q Sepharose Fast Flow柱层析与Sephacryl S-400柱层析联合分级纯化方法。在研究层次上,形成了“制备-结构-功效-机制”的CCPSs四维立体系统研究成果。在研究内容上,首次建立CCPSs的制备方法,解析了其一级结构,确认其稳定AS斑块的作用,阐明稳定AS斑块的机制。这些研究对于促进田螺这种药食同源产品的深入开发,为AS相关疾病的中西医结合防治提供新的干预措施,以及为其它水产动物多糖的开发提供新思路等方面均具有重要的理论参考和现实意义。