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新孢子虫(Neospora caninum,N.caninum)是一种新发现的胞内寄生原虫,以犬科动物为终末宿主,牛、羊等为中间宿主,可引发动物新孢子虫病。新孢子虫病对奶牛的危害最为严重,主要造成母牛流产、产死胎以及新生犊牛的运动神经系统疾病,给畜牧业造成巨大经济损失。目前尚无有效防治新孢子虫病的药物或疫苗。在寄生虫与宿主的关系中,宿主通过产生免疫应答抵抗虫体感染,寄生虫亦能逃避宿主的免疫攻击。深入研究新孢子虫感染后宿主免疫应答是通过免疫手段控制该病的分子基础。细胞因子IFN-β是Ⅰ型干扰素家族的重要成员,在抵御病毒、细菌感染中发挥重要作用。IFN-β主要通过结合Ⅰ型干扰素受体,诱导免疫相关鸟苷三磷酸酶M蛋白(Immunity-related GTPase M proteins,IRGMs)和鸟苷酸结合蛋白(Guanylate-binding proteins,GBPs)等干扰素诱导蛋白表达抑制病原感染。线粒体是细胞内的多功能细胞器,其稳态与IFN-β产生密切相关。病原感染细胞会导致线粒体受损,激活天然免疫级联信号诱导IFN-β的表达;而传染性胃肠炎病毒等会诱导线粒体自噬清除受损的线粒体,从而减弱免疫信号的激活,以实现免疫逃避。最近研究表明弓形虫和疟原虫等寄生虫感染过程中IFN-β发挥不同的作用。然而,在新孢子虫感染后能否诱导IFN-β产生,以及IFN-β对新孢子虫感染的作用及机制尚不清楚。因此,本研究针对IFN-β在新孢子虫感染中的作用和IFN-β产生的分子机制尚不清楚的问题,以IFN-β为切入点,开展新孢子虫诱导IFN-β表达、宿主细胞线粒体损伤和线粒体自噬检测;IFN-β、宿主细胞线粒体损伤和线粒体自噬在新孢子虫感染中的作用分析;新孢子虫通过c GAS信号通路调控IFN-β表达的机制等系列研究,深入探究新孢子虫与宿主免疫互作反应,以期为新孢子虫的防治提供新的理论依据。主要内容和结果如下:1.IFN-β抗新孢子虫作用(1)新孢子虫诱导IFN-β表达的检测。新孢子虫感染小鼠、小鼠腹腔巨噬细胞和牛巨噬细胞后,通过荧光定量PCR检测IFN-β表达水平。结果表明,新孢子虫能够诱导IFN-β表达。(2)IFN-β在新孢子虫感染中的作用。新孢子虫感染IFN-β-/-小鼠、WT小鼠、小鼠腹腔巨噬细胞和牛巨噬细胞,同时设置IFN-β重组蛋白处理组,检测小鼠存活率、增重率、荷虫量变化和纳虫泡膜的完整性。结果显示,与WT小鼠相比,IFN-β缺失后加速小鼠的死亡、显著降低体重同时导致荷虫量升高;加入IFN-β重组蛋白显著增加小鼠的存活率、体重恢复并降低荷虫量。小鼠腹腔巨噬细胞的IFN-β能够破坏新孢子虫纳虫泡膜的完整性并抑制虫体增殖。用IFN-β重组蛋白处理牛巨噬细胞后,虫体数量减少。(3)IFN-β抗新孢子虫效应分子筛选。新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞后用IFN-β重组蛋白处理,荧光定量PCR筛选高表达的IRGMs和GBPs蛋白;新孢子虫感染IFN-β-/-和WT小鼠腹腔巨噬细胞进一步验证IRGM3和GBP9的表达情况;构建IRGM3和GBP9过表达载体和si RNA转染小鼠腹腔巨噬细胞或293T细胞,新孢子虫感染细胞后检测虫体的增殖情况并用透射电镜观察新孢子虫形态。结果显示,IFN-β能够促进新孢子虫感染巨噬细胞的IRGM3和GBP9高表达,而IFN-β缺失后表达降低;过表达IRGM3和GBP9新孢子虫纳虫泡膜完整性被破坏,并显著抑制虫体增殖;而敲降IRGM3和GBP9后虫体数量增加。2.新孢子虫通过宿主细胞线粒体损伤-c GAS信号通路诱导IFN-β产生机制(1)新孢子虫诱导巨噬细胞线粒体损伤的检测。新孢子虫感染小鼠巨噬细胞后,透射电镜观察巨噬细胞线粒体结构、流式细胞术检测线粒体膜电位以及荧光定量PCR检测胞质线粒体DNA(mitochondria DNA,mt DNA)含量。结果显示,新孢子虫感染后巨噬细胞线粒体出现明显皱缩,线粒体嵴受损,甚至呈现空泡化;线粒体膜电位显著降低并且胞质内mt DNA含量升高。(2)新孢子虫激活c GAS信号通路及对IFN-β表达的影响。新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞后,荧光定量PCR和Western Blot方法分析c GAS相关通路的激活情况;用mt DNA的消耗剂以及c GAS的si RNA和抑制剂处理后,检测c GAS相关通路的激活和IFN-β表达情况。结果显示,新孢子虫感染激活了c GAS信号,促进TBK1和IRF3的磷酸化;c GAS的si RNA和抑制剂以及mt DNA消耗剂抑制新孢子虫诱导的c GAS信号,降低了TBK1和IRF3的磷酸化水平,抑制IFN-β表达。(3)c GAS信号在新孢子虫感染中的作用。c GAS的si RNA和抑制剂处理新孢子虫感染的小鼠腹腔巨噬细胞,荧光定量PCR检测虫体数量;c GAS的抑制剂处理新孢子虫感染的小鼠,检测小鼠的存活率、增重率、荷虫量及IFN-β的表达。结果显示抑制c GAS信号后,小鼠巨噬细胞虫体数量显著增加;同时加速小鼠的死亡、显著降低体重、抑制IFN-β的表达并增加荷虫量。(4)新孢子虫感染牛巨噬细胞验证c GAS的作用。荧光定量PCR检测新孢子虫感染牛巨噬细胞后c GAS的表达水平;加入c GAS的抑制剂和激动剂后,荧光定量PCR检测虫体数量和IFN-β表达。结果显示新孢子虫促进牛巨噬细胞c GAS的表达;抑制c GAS后IFN-β表达降低,虫体数量增加;而c GAS激动剂处理后IFN-β表达增加,虫体数量降低。3.新孢子虫通过宿主细胞线粒体自噬调控c GAS信号通路抑制IFN-β产生机制(1)新孢子虫诱导宿主细胞线粒体自噬的检测。新孢子虫感染小鼠腹腔巨噬细胞后,透射电镜观察巨噬细胞线粒体状态、免疫荧光检测LC3和线粒体的共定位情况、荧光定量PCR检测mt DNA/n DNA比率以及Western Blot检测线粒体标志蛋白的变化情况。新孢子虫感染小鼠后分析腹腔灌洗液细胞和脑组织mt DNA/n DNA比率和线粒体标志蛋白的变化情况。结果显示新孢子虫感染后,受损线粒体周围出现双层膜结构、LC3与线粒体发生共定位、mt DNA/n DNA比率以及线粒体标志蛋白Hsp60和Tim23的表达量均显著降低。(2)线粒体自噬对新孢子虫诱导c GAS信号通路和IFN-β产生的影响。新孢子虫感染小鼠巨噬细胞后,用线粒体自噬的诱导剂(CCCP)和抑制剂(Mdivi-1)处理以分析线粒体自噬对c GAS通路激活情况、IFN-β的表达以及虫体的作用。结果显示,CCCP处理后显著降低c GAS的表达、TBK1和IRF3的磷酸化水平和IFN-β的表达水平,导致虫体量增加;而Mdivi-1处理后的结果相反。(3)线粒体自噬在新孢子虫感染中的作用。用CCCP和Mdivi-1分别处理新孢子虫感染的小鼠后,检测小鼠的存活率、体重变化、荷虫量以及IFN-β的表达情况。结果显示,CCCP处理后显著加速小鼠的死亡、降低体重、增加组织荷虫量并且抑制IFN-β的表达,而Mdivi-1处理组的结果相反。(4)牛巨噬细胞线粒体自噬对新孢子虫感染的作用。CCCP和Mdivi-1分别处理新孢子虫感染的牛巨噬细胞后,检测mt DNA/n DNA比率、IFN-β的表达以及虫体数量。结果显示,新孢子虫感染降低了牛巨噬细胞mt DNA/n DNA比率;CCCP处理后IFN-β的表达水平显著降低,虫体数量增加,而Mdivi-1处理的结果相反。综上所述,本研究首次确定新孢子虫感染能够诱导宿主IFN-β产生,且IFN-β通过调控效应分子IRGM3和GBP9的表达,破坏新孢子虫的纳虫泡膜而发挥抗新孢子虫作用。一方面新孢子虫导致宿主细胞线粒体损伤,mt DNA释放到胞质中激活c GAS-STING-TBK1-IRF3信号通路促进IFN-β的产生抵抗新孢子虫感染。另一方面新孢子虫引起宿主细胞线粒体自噬,抑制c GAS-STING-TBK1-IRF3信号通路抑制IFN-β的表达。通过以上研究,明确了IFN-β在新孢子虫感染中的作用,揭示宿主线粒体损伤诱导IFN-β表达的抗虫机制,以及新孢子虫通过引起宿主细胞线粒体自噬抑制IFN-β表达的虫体免疫逃避机制,为以IFN-β及其通路分子为新靶标的新孢子虫病防控策略提供依据。