基于HIV-1的重组慢病毒载体(LV)以其独特优点正成为病毒性疾病基因治疗领域的研究热点。一方面它作为一种载体,能高效转导细胞,持续且稳定地表达目的基因,可感染静息期和增殖期的细胞,不易引起宿主的免疫原性反应。在相关研究中,带有干扰素-β(IFN-β)基因的LV高效转导CD4+/PBMC,在细胞内外高效表达IFN-β,显著抑制HIV-1毒株的复制,表现出了抗HIV感染能力。另一方面,LV是由HIV病毒去除毒力基因改建而来,LV预先感染靶细胞,可能会对靶细胞起到保护作用,能干预或阻断野生毒株的再感染。悉尼血库(Sydney Bank Cohort,SBBC)的一份关于关于艾滋病人长期生存的调查报告表明,HIV-1 nef缺失减毒株共感染,能显著延长HIV-1感染者的生存期。本实验室前期研究表明,在HIV感染的人群中,GBV-C的病毒载量和HIV-1病毒载量存在着负相关性,CD4+细胞数目和GBV-C病毒载量存在着正相关性。GBV-C或HIV-1 nef缺失的减毒株的共感染可能对HIV-1感染靶细胞起到一定的保护作用,抵抗HIV-1的感染。这种抵抗能力可能取决于宿主体内的靶细胞预感染率和持续时间。在自然状况下,GBV-C或缺失nef的HIV-1减毒株共感染抵抗HIV-1感染的作用较弱,可能是与不能保护足够数量的靶细胞有关。　　 我们假设,如构建一种携带干扰素(IFN)的重组慢病毒,高效转导靶细胞,发挥病毒持续性共感染及IFN双重抗病毒作用,可能会探索出一种治疗病毒性疾病的新的途径。　　 基于这个科学假说,首先制备了不同启动子的重组慢病毒,测定对不同细胞的转导效率。实验构建了含EF1α、CMV、Ubiquitin三种不同启动子的转移质粒,进而采用脂质体lip2000共转染三质粒载体系统方法,包装携带有绿色荧光蛋白的重组LV。针对转移质粒的3'-LTR部分,设计了用以测定LV载量的探针和引物,采用荧光定量PCR方法,测定包装的LV载量。用LV转导293A、MOLT-4、PC3、DU145、RM1细胞系及外周血单个核细胞,比较不同内部启动子的LV在各种细胞系中的转导效率,并监测目的基因GFP在293A细胞中能否持续稳定的表达。高效包装的带有绿色荧光蛋白的重组LV,载量为109 copies/ml以上,过滤浓缩后可达1011 copies/ml。不同启动子驱动的绿色荧光蛋白表达效果比较:以293A和PC3为靶细胞时,CMV启动子作用最强；以MOLT-4和DU145为靶细胞时,EF-1α启动子作用最强；在RW1细胞中,三种启动子的LV转导效率均较低,但Ubiquitin启动子作用略强。GFP在293A细胞中能够持续稳定表达,连续监测1个月,细胞状态良好。三种不同启动子的LV转导分离活化的PBMC,其中CD4阳性细胞比例均为30％左右,GFP阳性细胞比例为3％左右。　　 其次,制备了重组人干扰素慢病毒,测定其转导细胞后的干扰素表达水平。实验构建了三种不同启动子的重组IFNα和γ转移质粒即pTY-EF1α-IFNγ、pTY-EF1α-IFNα、pTY-CMV-IFNα、pTY-CMV-IFNγ和pFUGW-Ubi-IFNα。高效包装制备上述5种重组LV-IFN,病毒RNA载量为108-109 copies/ml。SYBRRT-QPCR检测到LV基因组中的IFNα和INFγ mRNA转录及整合到293A细胞基因组中的IFNα或γ基因,证实所构建的重组LV-IFNα/γ具有感染性。LV-IFNγ转导细胞12h后,以ELISA方法可以检测到细胞上清中IFNγ的表达,而LV-IFNα转导细胞后,上清中检测不到IFNα的表达。同样,Wester—blot检测到293A转导细胞内IFNγ表达,但未检测到IFNα表达。　　 最后,实验研究了重组干扰素慢病毒对腺病毒5型体外复制的影响。结果显示,4种重组LV-IFNα或IFNγ和腺病毒共感染293A时,各处理组之间腺病毒载量存在显著差异,F=44.611,P<0.001。经检验,方差不齐,采用Dunnett T3多重比较法,LV-EF1α-IFNγ、LV-CMV-IFNα、LV-CMV-IFNγ、LV-Ubi—IFNα四种重组LV能显著抑制腺病毒复制。从荧光显微镜观察,重组的LV能对细胞起到一定的保护作用,表现为重组LV共感染组293A细胞生长状态较好。　　 本研究成功包装生产出了高滴度重组LV,揭示不同启动子驱动外源基因在不同细胞和组织中的基因调控能力不同,提示在实际应用中,转导不同的靶细胞,应选择适宜启动子的重组LV。重组LV转导PBMC效率较低,将进一步研究其因为和提高其转导效率。实验建立的高滴度重组LV-IFN系统,转导效率高,在共感染过程中,证实能够显著抑制腺病毒复制。这为以后利用该重组LV-IFNγ或IFNα进行HIV/AIDS病毒性疾病的治疗提供了参考依据。