【摘 要】
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禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种严重传染病,目前该病的疫苗免疫效果并不理想,亟需开发新型疫苗以提高该病的防治效果。近年来,纳米载药系统如脂质体、纳米乳、金纳米粒、碳纳米管等受到了研究人员的高度关注,纳米载药系统具有调节药物在体内的释放速度,增加生物膜的通透性,提高药物利用率减小毒副作用等优势,红细胞作为天然的长循环体,红细胞膜包裹纳米颗粒作
【基金项目】
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四川省应用基础研究计划项目（2021YJ0289）；
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禽网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是危害养禽业的一种严重传染病,目前该病的疫苗免疫效果并不理想,亟需开发新型疫苗以提高该病的防治效果。近年来,纳米载药系统如脂质体、纳米乳、金纳米粒、碳纳米管等受到了研究人员的高度关注,纳米载药系统具有调节药物在体内的释放速度,增加生物膜的通透性,提高药物利用率减小毒副作用等优势,红细胞作为天然的长循环体,红细胞膜包裹纳米颗粒作为一种可靠的仿生纳米递送系统得到了广泛的应用。如果将该仿生纳米粒的表面进行可免疫器官靶向的修饰可显著提高疫苗递送。本试验拟将禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）特异性抗原基因gp90与壳聚糖制备成纳米粒,同时在纳米粒的表面包衣红细胞膜进行仿生修饰,然后在膜表面连接甘露糖,使其成为可靶向甘露糖受体的APCs靶向仿生纳米疫苗,并研究其在体外及体内的免疫活性,为提高RE的防治效果提供参考依据。（1）仿生纳米疫苗的构建与鉴定:将gp90 DNA与真核表达载体p TT5构建p TT5-gp90质粒,然后使其通过静电吸附与带正电的羧甲基壳聚糖结合,以确保质粒的稳定性。利用脂质体挤出器将鸡红细胞膜包裹在纳米粒外层,制成负载DNA的仿生纳米粒,并通过磷脂-聚乙二醇-甘露糖（DSPE-PEG-Man）对纳米粒进行修饰制成仿生疫苗载体系统（CS-gp90@M-M）,并对构建的甘露糖受体靶向仿生纳米疫苗的粒径、电位等表征进行测定。结果显示,本试验成功的将gp90基因插入到p TT5真核表达载体构建了p TT5-gp90质粒,与羧甲基壳聚糖静电吸附后正负电荷得到中和,红细胞包裹后的仿生纳米疫苗粒径在150 nm左右,形态呈球型,壳-核结构明显。然后经过红外光谱和拉曼光谱显示,DSPE-PEG-Man也成功的连接到了细胞膜上。（2）体外试验:研究CS-gp90@M-M对体外培养的鸡巨噬细胞的毒性,以及巨噬细胞对CS-gp90@M-M的吞噬及内化效率;然后通过对鸡巨噬细胞分泌一氧化氮（NO）及诱导型一氧化氮酶（i NOS）m RNA表达的影响从而研究CS-gp90@M-M的免疫活性。体外试验发现,构建的CS-gp90@M-M纳米疫苗给药平台具有良好的体外生物相容性。通过共聚焦显微镜观察发现鸡巨噬细胞对CS-gp90@M-M纳米粒摄取增多,同时上调了鸡巨噬细胞NO的分泌及i NOS m RNA表达水平。（3）体内试验:将CS-gp90@M-M免疫接种雏鸡,探究CS-gp90@M-M对免疫雏鸡REV特异性抗体水平、血清白介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）含量以及通过q PCR分析免疫反应关键调控因子的基因表达变化,利用小动物活体成像系统对Di D亲脂染料荧光标记的CS-gp90@M-M在肝脏、脾脏和法氏囊在内的免疫组织中的分布进行研究,探究CS-gp90@M-M对REV感染雏鸡的保护。体内试验发现,血清中的IL-4和IFN-γ水平均显著升高,抗体滴度也显著升高。接种疫苗雏鸡的脾脏和法氏囊中检测到免疫相关基因的m RNA水平不同程度升高,其中在脾脏和法氏囊中IFIH1的表达上调明显。攻毒保护试验结果显示,CS-gp90@M-M纳米疫苗对雏鸡具有持久的免疫保护效果,可以保护雏鸡免受REV的感染。本试验结果表明,构建的新型甘露糖受体靶向鸡红细胞膜包裹的壳聚糖DNA纳米疫苗具有良好的生物相容性和免疫保护作用,红细胞膜仿生和甘露糖对仿生纳米粒的靶向修饰显著提高了疫苗的免疫效果。该新型DNA疫苗为REV的防治及乃至其他禽类病毒性疾病的防治提供了新的思路。
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