家兔骨形态发生蛋白-7(BMP-7)cDNA的克隆与表达

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:jerryhua1987
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本研究主要目的是对家兔BMP-7基因的结构特征进行分析,为研究BMP-7基因在胚胎的发生和发育以及其它生殖生理过程的作用提供参考。主要得到以下一些结论:1)结合数据库已有的兔BMF-7基因部分编码序列,采用RT-PCR与RACE技术,从家兔肾脏组织中克隆到一条长1654bp包含了家兔BMP-7基因大部分cDNA的序列(GenBank:EU004072;EF583950;EU599645),该基因序列含有信号肽段除外的其它区段(缺少第1位氨基酸的前肽和成熟蛋白):446 bp长的3’非翻译序列(3’UTR)。其中,417bp,编码139个氨基酸残基的成熟肽CDS,其编码蛋白的理论分子量为15.6 kDa,理论等电点(PI)为8.04。该序列将已有的序列向5’和3’端分别延伸了395 bp和640 bp。2)序列对比表明,克隆的家兔BMP-7基因CDS部分(1205 bp)人、小鼠的对应序列的相似性分别为91.89%、89.32%,预测的氨基酸序列相似性分别为96.51%、96.01%。家兔BMP-7 3’UTR长446 bp,具有2个转录终止信号(AAUAAA)位点和poly(A)11,与人、小鼠、牛、猪BMP-7 mRNA 3’UTR的相似性分别50.30%、41.45%、47.84%和57.91%。推测的家兔BMP-7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。因此,我们成功地克隆了BMP-7的大部分cDNA序列。另外,家兔BMP-7 3’UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。3)对家兔BMP-7基因的体内表达情况进行了分析,发现BMP-7基因在2月龄家兔体内许多组织中都表达。其中,BMP-7基因在心、脾组织以低丰度表达,在肺、脊髓、十二指肠以中等丰度表达,在肝、肾、脑中以高丰度表达。4)将家兔BMV7基因的成熟肽段克隆入pET32a原核表达载体后,成功构建了家兔BMp-7基因的原核表达系统pET32a-BMP-7/BL21(DE3)和pET32a-BMP-7/BL21(DE3)PlysS。表达的融合蛋白质大小约为33.2 kDa,包括了15.6 kDa的家兔BMP-7目的蛋白和17.6kDa的pET32a表达载体蛋白。根据目的蛋白的表达量,优化了IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表达的适宜条件。低温(20℃~30℃)条件下,IPTG诱导pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表达时,IPTG浓度不可过低,而为减少包涵体的形成,以26℃~30℃,0.1 mM IPTG,5 h诱导其表达;20℃~25℃,0.2 mM IPTG,8 h诱导其表达较合适。
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