动脉粥样硬化是动脉壁的慢性炎症过程,通过进行性斑块的形成和动脉管腔的变窄引发心脑血管疾病。当斑块破裂和血栓形成后,常见心血管疾病的表现为急性冠状动脉综合征、心肌梗死或中风。携带低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)的载脂蛋白运载的循环性胆固醇水平提高,将促进动脉粥样硬化和心血管疾病的发生。载脂蛋白结合细胞外基质中负电性的蛋白聚糖引起LDL驻留在内膜,更容易被活性氧或炎症细胞所释放的酶氧化生成氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)。Ox-LDL触发内皮细胞粘附分子的表达和趋化因子的分泌,连同血小板趋化因子的沉积共同驱动内膜免疫细胞浸润。动脉壁LDL的沉积是动脉粥样硬化病变的标志。氧化应激水平的提高促进LDL的氧化,ox-LDL通过多种机制参与动脉粥样病变过程。其中,ox-LDL可以破坏内皮细胞功能,而内皮功能紊乱先于动脉粥样硬化发生,是病变的早期事件。一氧化氮(Nitric oxide,NO)在调节血管功能方面发挥着重要功能,导致内皮受损的主要因素之一是NO合成和/或生物利用度降低。Ox-LDL由多种反应性醛类以及过氧化脂类物质构成,具有强氧化性,其诱导的氧化应激严重干扰内皮行使正常生理功能,包括以多种途径造成异常的NO合成和利用。蛋白质的亚硝基化修饰是一种处于动态变化且广泛存在的翻译后修饰,既参与NO的信号传导,又与细胞氧化还原微环境密切相关。据报道ox-LDL可以破坏生物大分子的结构,包括磷酸化和泛素化等翻译后修饰,但是目前还没有研究ox-LDL影响亚硝基化蛋白组的报道。糖萼分布在健康血管内皮表面,在维持血管稳态方面扮演着不容小觑的角色。糖萼主要由糖蛋白和蛋白聚糖构成,蛋白聚糖由核心蛋白和糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)共价连接形成。糖胺聚糖是一类具有异质性的线性多糖,可以发生不同程度的硫酸化修饰。其负电性既可以吸引正电荷的血浆蛋白、生长因子等停靠,又可以排斥不良分子接触内皮,起到屏障和分子筛的作用。糖胺聚糖的功能依赖与其相互作用的蛋白实现,通过调节这些蛋白的结构和活性参与生命活动。对于外界刺激,位于内皮细胞表面的糖萼首当其冲。在内皮中最主要的糖胺聚糖是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS),约占50%-90%,已有研究表明ox-LDL可以降解糖萼,但是并没有深入研究在此过程中HS在结构和含量的具体变化。糖和蛋白质都是细胞内重要的生物大分子,蛋白质是生命活动的主要承担者,糖作为能量和结构物质参与细胞构成和信号传导。液相色谱和高分辨质谱的联用技术可以实现高质量的色谱分离、高灵敏度和高分辨率的质谱检测,广泛应用于糖和蛋白质的分析领域,包括结构和序列的表征、相互作用的研究和组学层面上的定性定量分析。对于蛋白组学的研究,生物信息学工具不可或缺,借助多学科的交叉运用,将抽象的质谱数据转化为具象的功能语言,有助于深层次的理解和应用。对于糖胺聚糖分析,bottorm-up的分析策略相对成熟,即用酶法或者化学法将完整糖链降解成寡糖,经过液质联用技术表征寡糖结构。本论文选取人脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞系EA.hy926研究ox-LDL致内皮细胞氧化损伤的分子机制。依赖于液质联用的定量方法,并以western blot和生物膜光干涉技术(Bio-layer interferometry,BLI)等技术为辅助,我们从多组学的角度展开研究,分别为蛋白组、亚硝基化修饰组、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素结合蛋白(Heparan sulfate binding protein,HSBP),这四个层次在之前均尚未有报道。其中蛋白组的研究既揭示了ox-LDL导致内皮功能障碍的蛋白基础,又为亚硝基化修饰组提供了修饰蛋白的定量信息,使焦点放在异常亚硝基化修饰本身成为可能,同时还是HSBP筛选的基础。本论文丰富和拓展了当前对ox-LDL致内皮细胞氧化损伤的认知,利于深入了解致动脉粥样病变的分子基础,为今后心血管疾病临床样本的研究提供了有前景的实验方向和可行的技术支持。本论文的主要研究成果如下:1.定量研究了ox-LDL致内皮细胞氧化损伤的蛋白组应用基于二级质谱数据定量的iTRAQ方法结合高分辨质谱技术,分析了ox-LDL刺激下内皮细胞蛋白组的变化,从中筛选出260种差异表达的蛋白。借助生物信息学手段对差异表达蛋白进行功能注释和相互作用网络分析,深入了解并挖掘这些蛋白背后的含义。差异表达蛋白主要是胞外蛋白、膜蛋白和囊泡蛋白,具有酶活性、受体活性和糖胺聚糖结合的能力,参与应对外界刺激、创伤愈合、以及分泌和迁移等内皮细胞重要生理活动。在蛋白相互作用网络分析时发现转录、翻译和血小板脱粒相关的蛋白之间相互作用关系受影响最大。本部分内容用质谱相对定量方法研究了ox-LDL对内皮细胞蛋白组的影响,了解ox-LDL致内皮细胞氧化损伤的蛋白分子机制。2.分析了ox-LDL对亚硝基化修饰相关酶的影响作为一种可逆的氧化性翻译后修饰,蛋白亚硝基化是一种重要的NO信号传导通路,也与细胞氧化还原微环境密切相关。该修饰生理水平的维持是通过修饰和去修饰两个过程的平衡实现的。内皮细胞中与修饰相关的酶是NO合成酶eNOS,运用western blot检测到ox-LDL处理下内皮细胞中eNOS的表达量是减少的。与去修饰有关的酶GSNOR在ox-LDL诱导下的表达量也是明显减少的,但减少程度比eNOS小,这解释了内皮细胞整体亚硝基化蛋白的减少。3.定量分析了ox-LDL刺激下内皮细胞的亚硝基化蛋白组首次将iRAQ定量技术与生物素转化方法进行结合,建立了一种亚硝基化蛋白组的定量研究方法,并首次发现了半胱氨酸侧链巯基对iTRAQ试剂的反应性。本研究的焦点问题在于ox-LDL对于亚硝基化修饰本身的影响,因此在数据处理时排除了蛋白表达量变化引起对应亚硝基化修饰变化的情况。运用生物信息学工具研究了262种异常亚硝基化的蛋白,发现这些蛋白覆盖了从起始、延伸到终止的整个翻译过程。参与mRNA剪接和翻译的蛋白亚硝基化修饰更容易受到氧化应激的影响。经过相互作用网络和分子对接模拟,发现亚硝基化修饰是一种调节蛋白相互作用的分子机制。4.表征了ox-LDL刺激下内皮细胞糖萼中异常的硫酸乙酰肝素内皮细胞糖萼中最丰富的糖胺聚糖是HS,其负电性既为生长因子、血浆蛋白等提供停泊位点,又作为分子筛排斥非必需分子或者具不良效应的蛋白和细胞接触内皮。糖萼作为细胞表面的结构,率先受到外界刺激的干扰。开展这部分研究的基础是观察到ox-LDL处理组内皮细胞表面HS的荧光信号更加致密。利用多反应监测质谱技术对HS结构和含量的变化进行了表征:ox-LDL刺激下的HS含量减少了50%,但是硫酸化修饰(包括O-硫酸和N-硫酸)是增多的。利用电泳技术分析内皮细胞HS分子量的分布,发现分为三个不连续的区域,并且ox-LDL处理组的HS分子量范围更宽,并且低分子量组分含量偏高。因此,ox-LDL确实对内皮细胞表面HS的结构、含量和分子量产生了重要影响,破坏了糖萼的保护功能。5.筛选和分析了ox-LDL刺激下内皮细胞中的重要硫酸乙酰肝素结合蛋白糖胺聚糖一般通过调节与其相互作用的蛋白参与细胞活动。基于蛋白组定量数据,结合蛋白组芯片的信号信息,初步筛选出ox-LDL致内皮损伤过程中有重要作用的潜在HSBP。通过文献描述的结合蛋白特征序列,并将蛋白定位到细胞外,对满足以上条件的蛋白用BLI技术进行验证,由此建立了一套从蛋白组到HSBP的技术路线。基于蛋白组数据的功能富集结果,选择起关键作用的胎球蛋白(Alpha-2-HS-glycoprotein,AHSG)进一步深入研究。通过检测其与不同位置脱硫酸的HS的亲和力,了解不同位置硫酸基团对二者相互作用的贡献。免疫共定位结果显示HS促进内皮细胞对AHSG的内吞作用,可能是动脉粥样硬化病变中所减少的血清AHSG的去路。此外,尝试开发非抗凝肝素的功能时,初步发现其对ox-LDL刺激下的内皮细胞具有一定程度的保护作用,表现为细胞凋亡率下降,这提示非抗凝肝素在干预或者缓解ox-LDL致动脉粥样硬化过程中的潜力。