[研究背景]肺动脉高压是严重的不可逆的致死性疾病,而血管重塑是肺动脉高压发生发展过程中的重要病理生理过程——肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)的增殖和迁移可导致肺动脉中层肌层增厚以及平滑肌向非肌性毛细血管内延伸。细胞内钙稳态在肺动脉平滑肌细胞的收缩、增殖和迁移中有重要意义[31][32]。Piezo1机械敏感性通道作为非选择性阳离子通道蛋白之一,对Ca2+有透过性,而Ca2+在血管的生理病理中有着非常关键的调节作用。同时已有研究证实,Piezo1参与血管内皮细胞及平滑肌细胞的生理病理过程,现如今对Piezo1与血管的研究大多聚焦在血管内皮上,在动脉平滑肌方面,已有证实其参与小动脉的结构重塑。除此以外,Piezo1还参与了压力感受反射过程,直接参与人体血压的调控[7]。另外,在高血压患者中,Piezo1开放增加对动脉平滑肌细胞的增殖作用,进而影响其直径和血管壁厚度。既往有学者认为,肺动脉高压的重塑仅在中小动脉显著,是因为SOCC及ROCC在近心和末梢肺动脉动脉平滑肌上的表达有差异,进而对钙离子调控的能力有差异,特别是TRPC1、6在肺动脉及肺动脉平滑肌细胞的表达,末梢皆大于近心[28],它们分别介导SOCE和ROCE,在钙离子调控方面,两者介导的钙离子内流在末梢大于近心段[28]。且在缺氧情况下,末梢细胞胞内钙离子增高水平较近心段的增高水平更高。那么在Piezo1上是否也会存在相似的情况呢?在肺动脉的重塑中,中小动脉的重塑较大动脉显著,这是否与机械敏感性钙通道在不同直径的肺动脉上表达或功能的差异相关,另外,缺氧时肺小动脉痉挛,而大动脉基本不会发生这种情况,相关研究也表明同为离子通道的TRPC瞬时电位受体通道蛋白在肺内外动脉表达有差异,进而对Ca2+的调控作用也不同[28],那么Piezo1在中小动脉和大动脉的表达是否也有差异,或是否与上述情况相关,尚未有研究表明,有待进一步探究。[研究目的]本研究的目的是探索机械敏感性通道蛋白Piezo1在大鼠不同肺段的表达情况,及其对Ca2+的调控作用。[研究方法]1、分离肺内外动脉并分别培养原代细胞,运用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测两者Piezo1mRNA及蛋白表达水平。2、运用钙离子成像技术,对比肺内外动脉平滑肌细胞在Yoda1刺激下,由Piezo1介导的细胞内钙离子调控(包括钙内流及钙释放)的差异。3、分别培养肺内外动脉平滑肌原代细胞并进行低氧处理,检测Piezo1表达及由Piezo1介导的细胞内钙离子调控的差异。4、用细胞增殖实验CCK-8试剂盒检测在一定浓度Yoda1慢性刺激下,肺内外平滑肌细胞增殖情况。[实验结果]1.肺内外动脉平滑肌细胞中的Piezo1mRNA表达无明显差异;肺内动脉平滑肌细胞Piezo 1蛋白表达高于肺外平滑肌细胞。2.肺内外动脉平滑肌细胞上的Piezo1都能介导钙离子内流,且二者基础钙水平无差异,但较肺外动脉平滑肌,肺内动脉平滑肌细胞上的Piezo1在Yoda1的急性刺激下,可引起更高水平的钙内流;而在去除Yoda1刺激,换用含钙PSS基础液灌流后,一定时间内,肺内动脉平滑肌的胞内钙水平下降更显著。3.肺内外平滑肌细胞在钙释放的能力上无显著差异。4.一定浓度Yoda1慢性刺激使Piezo1通道开放,一定时间内可使肺内动脉平滑肌细胞增殖,肺外动脉平滑肌细胞增殖不明显。5.低氧对肺内外动脉平滑肌细胞Piezo1的表达及功能影响不大。分别对比正常氧情况,单纯低氧处理后的肺内外平滑肌细胞由Piezo1介导的钙内流程度无明显差异,在细胞相对基础钙水平及Yoda1对Piezo1激活的持续程度方面亦无明显差别。[实验结论]Piezo1蛋白在肺内外动脉平滑肌细胞上的表达存在差异,在激动剂Yoda1的急性刺激下,二者对钙内流调控水平有差异,且肺内动脉平滑肌细胞对Yoda1更加敏感;肺内外动脉平滑肌细胞的细胞器储存Ca2+及细胞器膜上Piezo1通道钙释放功能无明显差异,肺内外动脉在受到同样的刺激使Piezo1激活时,胞内的钙离子浓度增加主要是由膜上Piezo1介导的胞外钙内流所致;激活Piezo1通道,肺内动脉平滑肌增殖,肺外动脉平滑肌增殖不明显。