论文部分内容阅读
目的研究促胰岛细胞再生和增殖的蛋白REG3A对胰腺癌细胞恶性增殖的作用机制,明确REG3A与膜受体EGFR结合对胰腺癌细胞增殖促进作用;深入研究在IL-6介导的炎症环境中,REG3A激活JAK2/STAT3信号通路对胰腺癌发生和发展作用。以及研究Reg3g(与人REG3A同源性最高)过表达对胰腺癌形成的免疫学机制,确定关键靶细胞即树突状细胞(DCs)和CD8+T细胞,为研究胰腺癌发病机制和寻找胰腺癌的药物治疗靶点提供新思路。方法首先,以人胰腺癌细胞系SW1990、BxPC-3为研究对象,采用siRNA-REG3A干扰SW1990、BxPC-3细胞,通过MTT法,FACS检测细胞周期和凋亡,Real-time PCR和WB检测JAK2/STAT3、Cyclin D1、Bcl2、REG3A表达。进一步阻断JAK2、STAT3分子,研究JAK2/STAT3/REG3A正反馈环路。其次,采用免疫共沉淀分析REG3A介导何种受体激活下游JAK2/STAT3通路发挥促胰腺癌细胞增殖作用。随后,采用不同剂量的IL-6孵育BxPC-3细胞24h,筛选出IL-6介导JAK2/STAT3浓度依耐性上调REG3A的表达,采用siRNA-STAT3阻断JAK2/STAT3信号通路,明确IL-6是否通过JAK2/STAT3信号通路促进REG3A表达。采用Microarray寻找REG3A或IL-6作用于SW1990细胞的重要节点。随后,建立裸鼠皮下移植瘤模型,进一步明确REG3A联合IL-6对裸鼠体内肿瘤形成的作用机制研究。最后,研究REG3A对胰腺癌形成的免疫学机制。ELISA检测经Reg3g处理的DCs细胞24h分泌TGF-β、IL-10、IFN-γ、IL-12P70。FACS检测经Reg3g及Panc02细胞模拟的肿瘤微环境处理后的DCs表面分子CD86和MHC-Ⅱ的表达。构建皮下移植瘤及胰腺原位癌模型,待肿瘤形成后腹腔注射慢病毒Reg3g过表达质粒(p Reg3g)、Reg3g干扰质粒(shReg3g)两周后取样,分析小鼠胰腺组织及脾脏病理变化,血清生化指标,检测CD8+T、CD4+CD25+Foxp3+(Tregs)比例,DCs成熟和功能学指标,肿瘤相关通路及增殖相关基因的表达,炎症因子的表达。结果首先,采用siRNA-STAT3,AG490,siRNA-REG3A干扰STAT3,JAK2,reg3a表达后,可有效抑制reg3a对下游信号通路jak2/stat3的活化作用,及下游相关蛋白cyclind1和bcl2的表达及的reg3g自分泌,抑制肿瘤细胞增殖作用;同时采用免疫共沉淀明确reg3a结合细胞膜受体egfr,干扰egfr表达后,reg3a不能激活jak2/stat3通路促进reg3a分泌,提示reg3a结合egfr激活jak2/stat3/reg3a环路,加速胰腺癌细胞增殖。随后,il-6促进bxpc-3细胞中reg3a的表达,在sw1990细胞中,采用sirna-stat3小干扰抑制stat3表达后,il-6不能有效激活jak2/stat3信号通路,促进reg3a的表达。随后,通过microarray基因分析初步筛选出reg3a与il-6均能活化胰腺癌细胞增殖相关(ras、tgf-β)信号通路,分子调控网络中stat家族为其关键节点。进而发现reg3a联合il-6体内和体外促进胰腺癌细胞恶性增殖。最后,reg3g抑制dcs的成熟,迁移和炎症细胞因子il-12、ifn-γ分泌,促进其吞噬功能及抗炎细胞因子il-10,tgf-β分泌;减弱局部肿瘤组织中cd8+t细胞浸润,诱导tregs表达上调及相关负性调控因子如cd152及pd-1和pd-l1的表达;封闭cd8+t细胞后,肿瘤体积明显增大,shreg3g不能发挥抑制肿瘤生长的作用,深入研究发现reg3g促进原位肿瘤的恶性增殖并介导免疫细胞中stat3通路发挥抑制dcs抗原提呈及与cd8+t细胞之间cross-talk作用,同时reg3g激活胰腺癌组织中stat3通路,促进下游分子ki67过表达,下调socs3、caspase3的表达,促进胰腺癌的形成和发展。结论il-6结合il-6r和gp130受体,激活jak2/stat3促进reg3a分泌。reg3a结合膜受体egfr也可通过该通路促进自分泌,形成jak2/stat3/reg3a环路。深入研究发现在il-6诱导的炎症环境中reg3a体内和体外促进胰腺癌细胞恶性增殖。同时通过皮下移植瘤及胰腺原位癌模型研究发现reg3g促进胰腺癌形成的免疫学机制,初步明确,reg3g激活dcs细胞中stat3信号通路,抑制dcs成熟及对cd8+t细胞抗原提呈能力,上调tregs数量,协同th2型细胞因子等免疫抑制发挥抑制肿瘤免疫应答。随后,封闭cd8+t细胞,明确reg3g抑制cd8+t细胞中stat3信号通路,抑制cd8+t对肿瘤的杀伤作用。同时reg3g活化肿瘤组织中stat3信号通路,促进肿瘤的发生和发展。创新点1.本研究首次阐明在IL-6介导的炎症环境中REG3A激活REG3A-JAK2/STAT3正反馈环路,促进肿瘤的形成。2.本研究首次采用原位胰腺移植瘤模型,明确Reg3g抑制DCs成熟,CD8+T杀肿瘤作用,及CD8+T细胞与DCs细胞间的cross-priming,诱导Tregs等免疫抑制性细胞的数量,即为Reg3g促进胰腺癌形成的免疫学机制。