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背景与目的口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma,OSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤之一,其导致患者死亡的主要原因是早期颈部转移、治疗后复发和远处转移。虽然近几年其治疗方式不断完善,例如手术治疗、辅助化疗和放疗,但患者的五年生存率仍未得到有效改善。因此,探究OSCC发生发展的分子机制,寻求更有效的治疗方式具有十分重要的临床意义。由于OSCC致病因素和肿瘤微环境的复杂性,其疾病发生发展过程中参与调控OSCC肿瘤增殖、迁移和细胞凋亡等恶性生物学行为的分子机制尚未完全阐明。文献报道指出NOTUM作为一种α/β水解酶,其参与多种疾病进展,如牙周炎、骨质疏松、神经性疾病。近年来,NOTUM与癌症的相关性也逐渐成为研究的热点。研究表明NOTUM在肝癌和肠癌组织中表达增加,其可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移。然而,NOTUM在OSCC方面所发挥的调控作用尚未见相关报道。因此,本研究旨在探究NOTUM在OSCC组织和细胞中的表达水平及其对OSCC细胞生物学行为的调控作用,并阐明其可能的作用机制,希望为OSCC肿瘤治疗提供有效靶点。材料与方法1、检测NOTUM在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中的表达（1）从UCSC Xena数据库下载TCGA-HNSC数据库,并筛选出305个OSCC样本和30个对照样本进行生物信息学分析,探究NOTUM在OSCC组织和对照样本中的表达差异;采用免疫组织化学染色方法检测NOTUM、PCNA和Ki-67在OSCC组织和正常组织中的表达情况。（2）采用Western blot、qRT-PCR及ELISA等实验方法检测OSCC细胞系（Cal-27、Scc-15）和口腔正常上皮角质细胞系（HOK）中NOTUM的表达,并通过细胞免疫荧光观察其在OSCC细胞系（Cal-27、Scc-15）中的表达情况。2、评价NOTUM对OSCC细胞生物学行为的调控作用（1）NOTUM过表达质粒和敲低干扰RNA的构建及鉴定采用细胞荧光检测OSCC细胞系（Cal-27、Scc-15）的转染效率,实时荧光定量（qRT-PCR）鉴定和筛选NOTUM过表达质粒和敲低干扰RNA,证实NOTUM在OSCC细胞中被过表达和敲低。（2）体内、体外实验观察NOTUM对OSCC细胞增殖、迁移和凋亡的影响采用CCK8、Western blot、qRT-PCR和克隆形成实验检测人重组蛋白NOTUM、NOTUM过表达质粒和NOTUM敲低干扰RNA对OSCC细胞增殖的影响;划痕愈合实验、Transwell迁移实验和qRT-PCR检测人重组蛋白NOTUM、NOTUM过表达质粒和NOTUM敲低干扰RNA对OSCC细胞迁移的影响;Western blot、qRT-PCR和流式细胞术检测NOTUM敲低对OSCC细胞凋亡的影响;体内裸鼠成瘤实验检测NOTUM敲低对OSCC肿瘤生长的影响。3、探究NOTUM调控OSCC细胞生物学行为的作用机制（1）生物信息学分析和筛选NOTUM与OSCC组织相关的信号通路通过基因富集分析软件（GSEA）和蛋白互作分析（PPI）筛选NOTUM在OSCC组织中相关的信号通路及互作蛋白。（2）检测NOTUM敲低对Sonic hedgehog通路的影响采用Western blot和qRT-PCR检测NOTUM敲低对Sonic hedgehog信号通路的影响;免疫组织化学染色检测Sonic hedgehog信号通路的配体Shh在人OSCC组织和体内裸鼠成瘤肿瘤组织石蜡切片中的表达情况。（3）检测Shh敲低对NOTUM促进OSCC细胞增殖和迁移的影响构建Shh敲低的干扰RNA,采用qRT-PCR鉴定和筛选Shh干扰RNA;qRT-PCR检测Shh敲低对人重组蛋白NOTUM促进OSCC细胞增殖和迁移的影响。（4）检测GSK3β磷酸化水平在NOTUM调控OSCC细胞过程中对Sonic hedgehog信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的偶联作用采用qRT-PCR检测OSCC组织中NOTUM与Wnt信号通路重要靶点β-catenin的相关性;免疫组织化学染色检测人OSCC组织和体内裸鼠成瘤肿瘤组织石蜡切片中β-catenin的表达;Western blot检测Shh敲低时,人重组蛋白NOTUM在调控OSCC细胞增殖和迁移过程中对Wnt/β-catenin信号通路的影响;通过外源性添加p-GSK3β的激动剂Licl,采用qRT-PCR检测GSK3β磷酸化水平对NOTUM敲低抑制OSCC细胞PCNA和MMP2 mRNA水平的影响。Western blot检测在NOTUM敲低抑制OSCC细胞增殖和迁移的过程中GSK3β磷酸化水平对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果1、NOTUM在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中高表达生物信息学结果显示:与口腔健康组织相比,NOTUM高表达于OSCC组织;免疫组织化学染色结果显示:与口腔健康组织相比,NOTUM和增殖标记物（Ki-67、PCNA）共同高表达于OSCC组织;体外细胞实验结果显示:与口腔正常上皮角质细胞（HOK）相比,NOTUM高表达于OSCC细胞。2、NOTUM促进OSCC细胞增殖和迁移、抑制其凋亡细胞实验结果表明,人重组蛋白NOTUM呈剂量依赖性（0、1、2和4μg/mL）和时间依赖性（0、24、48和72小时）促进OSCC细胞的增殖和迁移。NOTUM过表达显著促进OSCC细胞的增殖和迁移;NOTUM敲低促进OSCC细胞的凋亡;体内裸鼠成瘤实验结果显示NOTUM敲低可显著抑制OSCC肿瘤的生长。3、NOTUM通过Shh/p-GSK3β/β-catenin信号通路促进OSCC细胞的增殖和迁移GSEA和PPI分析结果显示在口腔鳞状细胞癌组织中NOTUM与Sonic hedgehog信号通路具有相关性,尤其是Sonic hedgehog信号通路的配体Shh;qRT-PCR结果显示NOTUM敲低组Sonic hedgehog信号通路相关因子Ptch1、Gli1和Shh的mRNA水平降低;Western blot显示NOTUM敲低组Shh蛋白水平降低;为了进一步验证Shh对人重组蛋白NOTUM促进OSCC细胞增殖和迁移的影响及分子机制,本研究构建了 Shh的小干扰RNA,qRT-PCR结果显示Shh敲低可以抑制人重组蛋白NOTUM对OSCC细胞增殖和迁移的影响;Western blot结果显示,Shh敲低后Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin蛋白表达减少,GSK3β的磷酸化水平降低;qRT-PCR和免疫组织化学染色结果显示β-catenin高表达于OSCC组织;为了进一步明确GSK3β磷酸化水平在NOTUM调控OSCC细胞过程中对Sonic hedgehog信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的偶联作用,本部分添加了p-GSK3β的激动剂Lic1,Western blot结果显示,p-GSK3β表达的增加可以挽救NOTUM敲低对OSCC细胞增殖和迁移的抑制作用,并且激活了 β-catenin的表达。结论1、NOTUM在OSCC组织和细胞中均高表达。2、人重组蛋白NOTUM和NOTUM过表达促进OSCC细胞增殖和迁移,NOTUM敲低抑制OSCC肿瘤的生长,促进OSCC细胞凋亡。3、NOTUM作为一种分泌蛋白通过Shh/p-GSK3β/β-catenin信号通路调控OSCC细胞生物学行为,其有望成为OSCC临床治疗的有效靶点。