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目的:上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是最常见的一种卵巢恶性肿瘤,发现时多为晚期。尽管近年来医疗水平在不断提高,上皮性卵巢癌的总体生存率仍较低,主要原因在于缺乏有效的预防措施、早期诊断困难以及化疗耐药所导致的复发。上皮性卵巢癌,尤其是II型上皮性卵巢癌,大部分伴有遗传性突变,包括TP53基因的功能突变、染色体不稳定、体细胞突变、DNA损伤修复缺陷及同源重组缺陷等,继而引起一系列原癌基因激活、抑癌基因失活及信号通路异常,导致上皮性卵巢癌的发生发展。因此,寻找出上皮性卵巢癌发生发展过程中的关键基因和调节通路能促进卵巢癌的早期诊断并改善治疗现状,从而提高卵巢癌患者的生存率。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种内源性非编码RNA,功能复杂,包括作为ceRNA发挥mi RNA海绵作用、调节基因的转录及翻译、与蛋白质相互作用,部分circRNA甚至能编码蛋白质,近年来在肿瘤领域中研究更广泛的是miRNA海绵作用。Circ-PGAM1属于circRNA,由其亲本基因磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1,PGAM1)转录而来,已有研究报道PGAM1在小细胞肺癌、胰腺导管腺癌及口腔鳞状细胞癌中促进肿瘤细胞的增殖和转移,发挥促癌作用。MiR-542-3p属于microRNA,文献报道miR-542-3p能通过激活P53的靶标促进P53的表达,并能靶向结合Survivin等促癌基因,进而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡,在多种肿瘤中发挥抑癌作用。通过生物信息学数据库分析,预测到circ-PGAM1与miR-542-3p存在结合位点。CDC5L(Cell division cycle 5-like)蛋白在哺乳动物中广泛表达,可参与调节pre-mRNA的剪接,同时可作为转录因子激活下游靶基因,已有研究发现CDC5L在肝癌、结肠癌、前列腺癌中高表达,起促癌作用。生物信息学分析预测到miR-542-3p与CDC5L基因的mRNA的3’UTR存在结合位点。PEAK1(Pseudopodium enriched atypical kinase 1)是一种非受体型酪氨酸激酶,具有催化活性并参与调控细胞骨架和细胞移行,在多种肿瘤中被证实能起到促癌作用。通过生物信息学分析,CDC5L有可能通过结合PEAK1基因的启动子区而调控PEAK1的表达。基于上述理论基础,本课题拟研究circ-PGAM1、miR-542-3p、CDC5L和PEAK1在临床手术标本EOC组织及正常卵巢组织中的表达情况,并在体外及体内水平研究circ-PGAM1、miR-542-3p、CDC5L和PEAK1对卵巢癌细胞的恶性生物学行为的影响,进而研究它们之间相互调控的可能的作用机制。本课题重点研究circ-PGAM1在EOC组织和细胞中的表达和功能,进而深入地揭示EOC发生发展的分子机制,寻找出更多的EOC相关的特异指标,以期实现EOC的早期诊断和治疗,并改善EOC患者的治疗效果和生存率。研究方法:1、收集来自中国医科大学附属盛京医院妇产科手术患者的EOC组织和正常卵巢组织标本,同时培养人源的卵巢癌细胞系—SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES-2细胞,和人源胚肾细胞293T(HEK-293T细胞)。2、利用Realtime PCR检测EOC组织和细胞中circ-PGAM1和miR-542-3p的表达量;利用荧光原位杂交(FISH)实验确定circ-PGAM1和miR-542-3p在卵巢癌细胞(CAOV3和OVCAR3)中的定位;利用免疫组织化学实验确定EOC组织中CDC5L蛋白和PEAK1蛋白的定位;利用Western blot实验检测卵巢癌组织和细胞中CDC5L蛋白和PEAK1蛋白的表达量。3、通过细胞转染的方法构建circ-PGAM1沉默、miR-542-3p过表达和沉默表达、CDC5L过表达和沉默表达、PEAK1过表达和沉默表达的细胞系(CAOV3和OVCAR3),通过CCK-8实验检测CAOV3和OVCAR3细胞的增殖能力;通过Transwell实验检测CAOV3和OVCAR3细胞的迁移和侵袭能力;通过流式细胞术检测CAOV3和OVCAR3细胞的凋亡;同时应用Western blot实验检测CDC5L、PEAK1、ERK1/2、p-ERK1/2、JAK1、pJAK1、JAK2和p-JAK2蛋白的表达变化。4、应用双荧光素酶基因报告分析系统检测circ-PGAM1和miR-542-3p、miR-542-3p和CDC5L之间的相互作用及结合位点。5、应用RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)检测circ-PGAM1和miR-542-3p的结合作用,应用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测CDC5L和PEAK1启动子的直接结合作用。6、利用裸鼠皮下移植瘤实验检测circ-PGAM1和miR-542-3p对肿瘤生长的影响,并检测瘤组织中CDC5L、PEAK1、ERK1/2、p-ERK1/2、JAK2和p-JAK2蛋白的表达情况。结果:1、Circ-PGAM1在EOC组织中的表达升高,而线性PGAM1在EOC组织中的表达与正常卵巢组织相比无明显差异。在卵巢癌细胞系—SKOV3、CAOV3、OVCAR3和ES-2中检测到circ-PGAM1在CAOV3、OVCAR3中的表达较高,故选取CAOV3、OVCAR3作为本课题研究的细胞,通过FISH实验检测到circ-PGAM1主要在细胞浆表达。沉默circ-PGAM1能抑制CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进细胞的凋亡。2、MiR-542-3p在EOC组织中的表达降低,通过FISH实验检测到mi R-542-3p也主要在细胞浆中表达,过表达miR-542-3p能抑制CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进细胞的凋亡。3、双荧光素酶基因报告分析实验证实circ-PGAM1与miR-542-3p存在靶向结合作用,RIP实验证实circ-PGAM1与miR-542-3p的结合有RNA诱导沉默复合体(RISC)的参与,沉默circ-PGAM1促进了miR-542-3p的表达,而过表达mi R-542-3p能下调circ-PGAM1的表达。4、沉默circ-PGAM1同时过表达miR-542-3p能够抑制CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时促进细胞的凋亡,而沉默miR-542-3p可以抵消单纯沉默circ-PGAM1的抑肿瘤效应。5、CDC5L蛋白主要在细胞浆中表达,细胞核中也有少许表达,且在EOC组织中的表达明显高于正常卵巢组织。双荧光素酶基因报告分析实验证实CDC5L与miR-542-3p存在靶向结合作用。沉默circ-PGAM1能抑制CDC5L mRNA和蛋白的表达;过表达miR-542-3p也能抑制CDC5L mRNA和蛋白的表达,而沉默miR-542-3p能促进CDC5L mRNA和蛋白的表达;沉默circ-PGAM1同时过表达miR-542-3p能明显抑制CDC5L mRNA和蛋白的表达,但沉默circ-PGAM1同时沉默miR-542-3p后CDC5L mRNA和蛋白的表达无明显变化。6、过表达CDC5L能促进CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时抑制细胞的凋亡,而沉默CDC5L能抑制CAOV3、OVCAR3细胞的恶性生物学行为。此外,CDC5L能直接与PEAK1基因的启动子区结合,过表达CDC5L能促进PEAK1蛋白的表达,而沉默CDC5L能抑制PEAK1蛋白的表达。7、PEAK1蛋白在EOC组织中的表达明显高于正常卵巢组织,且主要在细胞浆中表达。过表达PEAK1能促进CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,同时抑制细胞的凋亡,而沉默PEAK1能抑制CAOV3、OVCAR3细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡。过表达PEAK1后p-ERK1/2和p-JAK2的表达水平明显上升,但p-JAK1的表达无明显变化,证实PEAK1能调节ERK1/2和JAK2信号通路的活性,而对JAK1信号通路无影响。8、共转染miR-542-3p的过表达质粒和CDC5L的过表达或CDC5L 3’UTR缺失的质粒,证实miR-542-3p的过表达加CDC5L 3’UTR缺失质粒转染组细胞的增殖、迁移和侵袭能力较miR-542-3p和CDC5L同时过表达组升高,凋亡率也相应降低。此外,Western blot检测到miR-542-3p过表达加CDC5L3’UTR缺失质粒转染组PEAK1、p-ERK1/2和p-JAK2的表达水平较miR-542-3p和CDC5L同时过表达组组明显升高,证实miR-542-3p通过抑制CDC5L的表达,降低PEAK1的表达,进而调节ERK1/2和JAK2信号通路的活性。9、裸鼠皮下移植瘤实验证实单独沉默circ-PGAM1或过表达miR-542-3p都能够抑制肿瘤的生长,而沉默circ-PGAM1同时过表达miR-542-3p能最大程度地抑制肿瘤的生长。此外,单独沉默circ-PGAM1或过表达miR-542-3p组CDC5L、PEAK1、pERK1/2和p-JAK2蛋白的表达水平均降低,但沉默circ-PGAM1同时过表达miR-542-3p组CDC5L、PEAK1、p-ERK1/2和p-JAK2蛋白的表达水平最低。结论:1、Circ-PGAM1、miR-542-3p、CDC5L和PEAK1在EOC组织和细胞中均有内源性表达,其中,circ-PGAM1、CDC5L和PEAK1在EOC组织中的表达升高,miR-542-3p在EOC组织中的表达降低。2、Circ-PGAM1、CDC5L和PEAK1均能促进卵巢癌细胞的恶性生物学行为,而miR-542-3p能够抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。3、Circ-PGAM1和miR-542-3p在预测的结合位点能够靶向结合,并负性调控对方的表达,沉默circ-PGAM1通过上调miR-542-3p的表达,进一步抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为。4、MiR-542-3p能够靶向结合CDC5L mRNA的3’UTR,抑制CDC5L的表达,进而发挥抑制卵巢癌细胞的恶性生物学行为的作用。5、CDC5L蛋白能直接与PEAK1基因的的启动子区结合并促进其转录,发挥促进卵巢癌细胞的恶性生物学行为的作用。6、过表达PEAK1能在卵巢癌细胞中激活ERK1/2和JAK2信号通路,发挥促癌作用。7、在体内沉默circ-PGAM1同时过表达miR-542-3p能最大程度地抑制肿瘤的生长,并抑制了CDC5L、PEAK1蛋白的表达和ERK1/2和JAK2信号通路的活化,进一步验证了circ-PGAM1通过调控miR-542-3p/CDC5L/PEAK1通路促进EOC的恶性进展。