论文部分内容阅读
目的:研究发现人类表皮生长因子域EGFL6可促进组织血管新生并在肿瘤组织细胞中表达上调，预示其与肿瘤发生发展密切相关，本研究通过克隆EGFL6全长及片段基因，构建pET32a(+)-EGFL6全长及片段蛋白原核表达载体，诱导表达并鉴定全长EGFL6蛋白及片段蛋白，并利用EGFL6片段蛋白免疫制备抗EGFL6多克隆抗体，应用其检测人肿瘤细胞系中EGFL6全长蛋白，为深入研究EGFL6的相关功能奠定了基础。方法:（1）全长人EGFL6基因的亚克隆与原核表达：以本实验室保存的EGFL6载体质粒为模板PCR扩增EGFL6全长基因，将其连接到pMDTM18-T经克隆，测序，酶切鉴定正确后连接至表达载体pET32a(+)上，转化到克隆菌株以及表达菌株，同样通过双酶切鉴定正确后,进行诱导表达，SDS-PAGE及Western blot的方法检测和鉴定目的蛋白的表达。（2）肿瘤细胞株中EGFL6的表达检测，从8株不同肿瘤及正常细胞系中提取总RNA，经反转录成cDNA后，利用实时荧光定量PCR方法检测8株细胞系中EGFL6基因的表达水平。（3）肿瘤细胞株中EGFL6基因片段的克隆与表达：以表达水平最高的一株细胞cDNA为模板进行PCR扩增EGFL6片段基因，将其连接到pMDTM18-T载体上经克隆,测序和酶切鉴定正确后连接至表达载体pET32a(+)上，转化克隆菌株Ecoli.DH5α及表达菌株E coliRosetta-gami B，同样通过双酶切鉴定正确后,进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白的表达。（4）EGFL6片段的纯化、多克隆抗体的制备与检测：目标蛋白经大量表达后，利用镍离子亲和树脂进行纯化EGFL6片段蛋白，以纯化产物为完全抗原免疫昆明小鼠制备抗EGFL6的多克隆抗体，该多克隆抗体经辛酸-硫酸铵法沉淀后纯化后，作为第一抗体对A375，SKOV3及HUVEC细胞裂解物进行Western blot检测分析。结果:（1）全长人EGFL6基因的亚克隆与原核表达：DNA序列测定及双酶切鉴定结果均显示EGFL6全长基因成功构建至原核表达载体pET32a(+)上，原核表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后证实EGFL6全长蛋白主要以包涵体的形式表达于大肠杆菌的周质腔内，并且包涵体表达量占EGFL6蛋白表达总量的90%以上。（2）肿瘤及正常细胞系中EGFL6表达水平检测：荧光定量PCR结果显示8株肿瘤及正常细胞系中，A375及SKOV3细胞的EGFL6表达水平明显高于其余细胞株。（3）肿瘤细胞株中EGFL6基因片段的克隆与表达：以A375细胞株总cDNA为模板，RT-PCR成功扩增EGFL6基因片段，DNA序列测定以及双酶切鉴定的分析结果均表明pET32a(+)-EGFL6片段基因表达载体构建成功。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后证实EGFL6片段蛋白同时以包涵体和可溶性形式表达，并且各占表达总量的50%左右。（4）EGFL6片段的纯化、多克隆抗体的制备与检测应用：以纯化得到的EGFL6重组蛋白免疫制备得到小鼠血清，间接ELISA方法测得其效价为1：320000。Western blot结果表明,抗血清均能够特异地识别重组片段蛋白和重组全长蛋白。利用纯化后的抗EGFL6抗体对A375，SKOV3及HUVEC细胞裂解物进行Western blot检测，结果显示抗EGFL6多抗能特异性识别细胞系中天然EGFL6蛋白，同时， EGFL6蛋白在A375及SKOV3细胞系中表达量明显较HUVEC高，与前期荧光定量RT-PCR结果相符合。结论：从8株不同的肿瘤与正常细胞中筛选出高表达EGFL6的A375与SKOV3细胞，从A375细胞中克隆出EGFL6基因片段，并在原核表达系统中实现了EGFL6包涵体形式的全长蛋白表达及可溶性EGFL6片段蛋白的表达，并且进行了多克隆抗体制备及其初步检测应用。