背景树突状细胞(Dendritic cell, DC)属于起源干细胞的白细胞范畴,是初始免疫反应中最重要的抗原提呈细胞,特异性激活T天然细胞。但是,树突状细胞及其前体在体内含量极少,而体外诱导外周血单个核细胞以得到足够数量的树突状细胞进行生物治疗,在标本来源上和技术上尚存在困难。脐血则来源丰富,一直废弃不用。近年来的大量研究发现,每单位体积脐血中的造血干细胞比骨髓和外周血干细胞量更多、更原始。有研究报道,外周血、脐血单个核细胞与GM-CSF、IL-4、TNFα共培养后可分化为功能性的树突状细胞。肿瘤患者树突状细胞的免疫功能不全,肿瘤细胞抗原加工机能下调、低表达或不表达共刺激分子,是使其产生免疫逃逸的主要原因。应用抗原提呈细胞-树突状细胞为中心的免疫治疗,是肿瘤生物学治疗的主要方向之一。本实验主要研究联合应用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-3 (IL-3)、干细胞生长因子(SCF)和促红细胞生成素(EPO)等细胞因子对脐血树突状细胞进行体外诱导、扩增,产生功能性树突状细胞,探索一种新的、可行的树突状细胞体外诱导及扩增方法,扩大脐血的应用范围。同时,由脐血单个核细胞(Human cord Blood mononuclear cell, CBMC)诱导分化出树突状细胞,使其负载HL-60/K562白血病细胞抗原,进一步诱导脐血单个核细胞产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes, CTL),观察CTL对HL-60/K562白血病细胞的特异性杀伤效应,为DC在白血病生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据,也为脐血的再利用提供实验依据。目的1.分析脐带血与外周血的细胞组成情况及二者树突状细胞含量变化,探索获得树突状细胞的来源及脐血再利用的可能性。2.以脐血为来源探索体外应用细胞因子诱导、扩增树突状细胞的方法并进行表型鉴定。3.观察研究脐血树突状细胞负载冻融的HL-60、K562白血病细胞抗原,体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HL-60、K562的杀伤作用,为树突状细胞在白血病生物学免疫治疗中的临床应用提供实验依据,也为脐血的再利用提供实验依据。方法1.正常成人外周血9例,脐血12例,分离单个核细胞。2.应用流式细胞仪,使用CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD83、CD1a、CD11c、和CDw123等单克隆抗体,测定正常成人外周血和脐血细胞的细胞表面抗原变化及树突状细胞情况。3 .在脐血单个核细胞中加入细胞因子GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor)、IL-3 (interleukin 3)、SCF (stem cell factor)和EPO (erythropoietin),培养3-4周。4.应用流式细胞仪,使用CD4、CD8、CD19、CD34、CD38、CD1a、CD11c、和CDw123等单克隆抗体,测定培养前及培养后2-4周脐血细胞的细胞表面抗原变化及树突状细胞扩增情况,ELISA方法检测培养上清IL-12含量。5.使树突状细胞负载HL-60、K562白血病细胞抗原,致敏脐血T淋巴细胞,产生CTL,3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果1.正常成人外周血CD4+细胞占35.36%、CD8+细胞23.44%、CD19+细胞5.07%、CD38+细胞5.07%,CD34+造血干细胞数为0.15%、树突状细胞CD1a+细胞为0.05%、CD11c+细胞为13.96%、CD83+细胞为3.61%、CDw123+细胞4.29%。脐血单个核细胞中CD4+细胞占33.43%、CD8+细胞18.9%、CD19+细胞5.98%、CD38+细胞25.04%,而CD34+造血干细胞数为0.59%、树突状细胞CD1a+细胞0.81%、CD11c+细胞为18.04%、CD83+细胞为5.49%、CDw123+细胞为8.43%。脐血细胞CD34、CD38、CD1a阳性细胞数明显高于外周血(P<0.01)。2.正常成人外周血CD34+造血干细胞数为0.02x105/ml、树突状细胞CD1a+细胞为0.01x105/ml、CD11c+细胞为4.32x105/ml、CD83+细胞为1.31x105/ml、CDw123+细胞1.41x105/ml。新鲜脐血单个核细胞中CD34+、CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+细胞数分别为0.22 x105/ml、0.27x105/ml、5.87 x105/ml、1.94 x105/ml、2.73 x105/ml。3.加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、EPO后培养的脐血单个核细胞分化为CD1a+、CD11c+、CD83+、CDw123+树突状细胞,在培养的2-4周,脐血树突状细胞数量明显增多,数量增加分别达11.02x105/ml、28.24x105/ml、10.57x105/ml、18.7x105/ml,与培养前比较有显著性差异(P<0.01)。4.加入细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、EPO培养后,脐血大部分细胞显示出明显的树突状细胞的形态学特征,细胞胞体明显增大,胞浆丰富,细胞核呈不规则形,胞膜有大量明显的伪足,可见典型的细长的树枝状突起,呈典型树突状细胞特征。5.诱导培养前上清几乎无IL-12分泌,培养1周开始出现IL-12分泌,量为4.47±1.62ng/ml,培养2W、3W、4W的IL-12分泌量分别为6.26±3.09ng/ml、6.92±3.53ng/ml、5.81±2.87ng/ml。各组实验结果与培养前比较有统计学意义(P <0.01),各组间实验结果差异无统计学意义(P >0.05)。6.冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为42.04%±8.46%和31.25%±11.07%,与其它实验组比较有显著性差异(P<0.01)。结论1.新鲜脐血与外周血比较,CD34、CD38、CD1a阳性细胞数明显高于外周血,CD83、CD11c、CDw123等抗原阳性细胞数略高于外周血。提示,新鲜脐血中含有更多的CD34+细胞和早期树突状细胞,体外应用细胞因子诱导将可能产生更多的功能性树突状细胞。2.联合应用细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、Epo培养的脐血单个核细胞可分化为CD83+、CD1a+、CD11c+、CDw123+树突状细胞,可有效刺激细胞分泌IL-12。新鲜脐血与培养3周的脐血树突状细胞数相比较,培养后CD83+细胞数增加3.57倍;CD1a+细胞数增加40.07倍;CD11c+细胞数增加3.67倍;CDw123+细胞数增加6.10倍。3.联合应用细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、Epo诱导脐血单个核细胞分化的树突状细胞具有免疫刺激活性,且树突状细胞与CBMC的细胞比例为1:40时的刺激活性最佳。4.细胞因子GM-CSF、IL-3、SCF、Epo诱导扩增的脐血树突状细胞经HL-60、K562白血病细胞抗原致敏后,对HL-60、K562白血病细胞具有较强的杀伤作用。对HL-60的细胞毒作用略强于K562。5.HL-60、K562冻融抗原致敏的DC诱导的抗肿瘤免疫具有特异性。应用冻融技术制备肿瘤抗原,具有操作简便,无需明确肿瘤抗原,递呈肿瘤抗原效率高的优点。6.脐血树突状细胞能应用于疾病的免疫治疗,脐血将成为肿瘤免疫治疗中树突状细胞的重要来源。这些树突状细胞作为抗原提呈细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。