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PRRS自20世纪末发现以来,已遍及世界主要养猪国家,给全球养猪行业造成了巨大经济损失。由于PRRSV具有高度变异特性、超强的免疫抑制和免疫逃逸能力,现有疫苗难以提供完全保护,而且没有抗PRRSV的特异性药物,导致PRRS的防控非常困难。因此,深入研究PRRSV与宿主的相互作用,筛选抗病毒宿主因子,挖掘潜在药物靶标,对有效防控PRRS具有重要意义。细胞胆固醇在有囊膜病毒的生命周期中起着至关重要的作用,而且大量的研究证实胆固醇及其代谢产物参与抗病毒天然免疫。目前,关于PRRSV如何调节细胞内胆固醇合成及其与宿主抗病毒天然免疫之间的关系尚不清楚。本研究分析了PRRSV感染调控细胞内胆固醇合成的分子机制,同时对胆固醇催化产物25-羟基胆固醇（25HC）的抗PRRSV作用以及PRRSV拮抗胆固醇25-羟化酶（CH25H）的抗病毒机制进行了深入研究。具体研究内容如下:1.PRRSV nsp4通过PP2A-HMGCR途径上调细胞内胆固醇水平分析了PRRSV（WUH-3株）感染后不同时间点猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和PK-15CD163细胞内胆固醇含量的动态变化,发现PRRSV感染显著上调细胞内胆固醇水平,而且上调胆固醇合成关键限速酶HMGCR的活性。进一步分析了调控HMGCR活性的两种蛋白酶AMPK和PP2A是否参与PRRSV上调HMGCR,结果发现PRRSV主要通过调控PP2A磷酸化上调HMGCR活性。为了确定PRRSV编码的哪种蛋白调控HMGCR,分析了PRRSV编码的所有病毒蛋白对HMGCR磷酸化的影响,发现PRRSV主要通过nsp4上调HMGCR活性;过表达实验进一步证实nsp4上调细胞内胆固醇水平,且不依赖其3C样蛋白酶活性。通过构建nsp4不同功能域截短体,证实PRRSV nsp4的domain I（1-80位氨基酸）与PP2A的结构亚基PR65α和催化亚基PP2Ac存在相互作用。过表达nsp4的domain I上调细胞内胆固醇的含量且抑制仙台病毒诱导的IFN-β产生,而这种抑制作用可被HMGCR抑制剂Lovastatin消除。Lovastatin预处理细胞显著抑制PRRSV诱导的胆固醇产生,同时也削弱了PRRSV对IFN-β的抑制作用。因此,Lovastatin明显抑制PRRSV的增殖。上述结果表明,PRRSV主要通过非结构蛋白nsp4上调细胞内胆固醇含量,且nsp4上调细胞内胆固醇含量是PRRSV拮抗宿主先天性免疫的策略之一。2.胆固醇25-羟化酶（CH25H）通过两种方式抑制PRRSV复制CH25H是一种内质网相关酶,可氧化内质网和高尔基体胆固醇生成25HC,减少细胞内胆固醇累积,而25HC又负反馈调控胆固醇合成。分析猪源CH25H（pCH25H）在PRRSV感染中的作用,发现过表达pCH25H明显抑制PRRSV复制,siRNA干扰细胞pCH25H表达则促进PRRSV感染,提示pCH25H是一个宿主限制因子。进一步分析了25HC对PRRSV感染的作用及其作用机制,发现25HC主要通过抑制PRRSV侵入细胞抑制病毒感染。在分析pCH25H的抗PRRSV作用时,还发现pCH25H酶活突变体pCH25H-M仍然具有抑制PRRSV感染的能力。通过酵母双杂交筛选、免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验,证实pCH25H和pCH25H-M均与PRRSV非结构蛋白nsp1α存在相互作用,而且可通过泛素蛋白酶体途径降解nsp1α。通过构建nsp1α潜在泛素化位点突变体,证实第169位赖氨酸（K169）是nsp1α被pCH25H/pCH25H-M泛素化降解的关键氨基酸位点。上述结果表明,pCH25H不仅可通过胆固醇的代谢产物25HC抑制PRRSV入侵细胞,而且还通过泛素蛋白酶体途径降解nsp1α,从而抑制病毒复制。3.PRRSV E蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解猪源CH25H进一步分析了PRRSV感染PAMs后不同时间pCH25H的表达水平,发现PRRSV感染下调细胞内pCH25H的蛋白表达,尤其在感染中后期,提示PRRSV可能采取某种策略拮抗pCH25H的抗病毒作用。进一步的分析发现,除了与nsp1α相互作用外,pCH25H还与PRRSV E蛋白存在相互作用,而且E蛋白和pCH25H共表达时可观察到明显的pCH25H降解。对E蛋白降解pCH25H的可能途径进行分析,证实E蛋白主要通过泛素蛋白酶体途径降解pCH25H。通过构建pCH25H潜在泛素化位点突变体,证实pCH25H的第28位赖氨酸（K28）是其被泛素化位点。有意义的是,该位点（K28）在人源、猴源和鼠源CH25H中不保守（均为精氨酸）,提示PRRSV E蛋白降解CH25H具有种属特异性,生物学实验也证实PRRSV E蛋白不能降解人源CH25H。鉴于PRRSV E蛋白特异性降解pCH25H,进一步分析了E蛋白过表达细胞以及PRRSV感染细胞内25HC的含量,发现E蛋白过表达细胞以及PRRSV感染中后期细胞内25HC含量显著下降。E蛋白过表达一方面降低了pCH25H对PRRSV的抑制作用,另一方面削弱25HC对炎症反应的抑制作用。上述结果表明,PRRSV E蛋白可通过泛素蛋白酶体途径降解pCH25H,是PRRSV拮抗宿主抗病毒作用、诱导晚期炎症反应的一种策略。