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盆底脏器脱垂（pelvic organ prolapse，POP）是由多种原因引起的盆底脏器位置及功能异常的疾病，发病率高，主要表现为阴道口组织脱出，严重者可伴有排尿、排便及性功能障碍，给患者的精神、生活及工作学习产生不同程度的影响。宫骶韧带（uterosacral ligament）是位于子宫体和子宫颈交界处后面的上侧方和第2、3骶椎前面的一条韧带，内含平滑肌、结缔组织和支持膀胱的神经等；此韧带向后向上牵引着子宫颈，维持子宫的前倾位置。当宫骶韧带受损时，盆腔支持结构薄弱，导致盆腔内器官下移，进而导致排便、排尿及性功能障碍。宫骶韧带中主要细胞组成成分为成纤维细胞，其分泌的胶原蛋白、弹性蛋白、氨基聚糖等为细胞外基质的主要成分。WNK基因1型（without-no-lysine（K）-1，WNK1）是最新发现的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因，其编码的多功能蛋白WNK1激酶可以调节细胞的增殖、凋亡及胚胎的发育等过程。通过全基因组测序发现POP患者韧带中的WNK1基因发生错义突变。有研究表明POP患者的宫骶韧带成纤维细胞增殖能力降低，形态明显受损，Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ,COLⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白（collagenⅢ,COLⅢ）含量减少。先前课题组初步对WNK1基因在POP中的作用就进行了研究，发现POP患者主韧带成纤维细胞的数量及COLⅠ的含量显著低于对照组，WNK1基因mRNA及蛋白表达水平也显著下降。但是否由WNK1基因过表达导致韧带中成纤维细胞的增殖减慢、胶原蛋白表达受阻暂无明确阐述。
目的:
测定WNK1基因的过表达对宫骶韧带中成纤维细胞增殖情况及COLⅠ、COLⅢ含量的影响，探讨WNK1基因对POP的发病作用机制，从而为POP的基因诊断和治疗提供思路。
方法:
1.标本采集：随机选择2018年1月～2019年1月无盆底功能障碍性疾病且因其他疾病行子宫切除的病人。取正常子宫宫骶韧带组织进行成纤维细胞培养。
2.成纤维细胞培养：采用胶原酶消化法对宫骶韧带成纤维细胞原代培养；采用差时贴壁法纯化成纤维细胞后传代培养；对细胞进行VIM免疫荧光染色，鉴定为成纤维细胞后进行转染。
3.慢病毒转染：构建WNK1慢病毒载体并转染成纤维细胞中。实验分为三组，WNK1+组：携有WNK1基因的慢病毒；试剂对照组：空载慢病毒；空白对照组：PBS溶液。
4.成纤维细胞增殖能力检测：显微镜下观察成纤维细胞的生长状态；CCK-8法检测成纤维细胞的增殖活性。
5.宫骶韧带成纤维细胞WNK1、COLⅠ及COLⅢ的表达：RT-qPCR及Western blot蛋白印迹法分别检测WNK1、COLⅠ及COLⅢ的mRNA及蛋白的相对表达量。
结果：
1.成纤维细胞的培养：经3代培养的成纤维细胞具备转染条件，显微镜下可见成纤维细胞相互融合成片，轮廓清楚，呈放射状、长索形、部分呈三角形，原代中有许多没有伸展的圆形细胞。复苏后的成纤维细胞生长状态良好，均可贴壁生长。通过VIM免疫荧光染色发现复苏后的细胞结果阳性表达，为成纤维细胞。
2.转染结果：WNK1+组中的WNK1蛋白表达量较空白对照组及试剂对照组显著升高，差异有统计学意义（P值分别为0.031、0.037）；试剂对照组的蛋白表达量与空白对照组相比差异无统计学意义（P=0.904）。
WNK1+组较空白对照组成纤维细胞数目较多，排列整齐，呈现长梭形、扁平星形或三角形；而试剂对照组较空白对照组成纤维生长状态无明显差异。
3.CCK-8实验结果：孵育12h后WNK1+组成纤维细胞的OD值与空白对照组相比无明显差异，P=0.087；孵育24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后的WNK1+组成纤维细胞的OD值显著高与空白对照组，差异均有统计学意义（P值分别为0.005、＜0.001、0.047、＜0.001、＜0.001、＜0.001、＜0.001）；孵育12h、24h、36h、60h、72h、84h、96h WNK1+组与试剂对照组相比显著增高，均有统计学意义（P值分别为0.021、0.005、＜0.001、＜0.001、0.001、＜0.001、＜0.001）；孵育48h WNK1+组与试剂对照组相比差异无统计学意义（P值为0.052）；孵育12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h试剂对照组OD值与空白对照组相比无统计学意义（P值为0.322、0.902、0.466、0.945、0.210、0.466、0.248、0.436）。
4.RT-qPCR结果：WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量较空白对照组显著上升，差异均有统计学意义（P值分别为0.016、0.011、0.031）；WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量与试剂对照组对比显著上升，差异均有统计学意义（P值分别为0.009、0.009、0.037）；试剂对照组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量与空白对照组比较无显著性差异（P值分别为0.666、0.852、0.891）。
5.Western blot检测结果：WNK1+组中的WNK1激酶、COLⅠ及COLⅢ的蛋白相对表达量高于空白对照组，结果均有统计学意义（P值分别为0.031、0.030、0.019）；WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的蛋白相对表达量与试剂对照组对比显著上升，差异有统计学意义（P值分别为0.037、0.021、0.030）；试剂对照组中WNK1激酶、COLⅠ及COLⅢ的蛋白的相对表达量与空白对照组相比无明显差异（P值分别为0.904、0.804、0.733）。
结论：
WNK1基因过表达不仅促进宫骶韧带中成纤维细胞增殖，而且促进成纤维细胞中COLⅠ、COLⅢ的合成，为POP的临床诊断和治疗提供了一定的理论依据。
目的:
测定WNK1基因的过表达对宫骶韧带中成纤维细胞增殖情况及COLⅠ、COLⅢ含量的影响，探讨WNK1基因对POP的发病作用机制，从而为POP的基因诊断和治疗提供思路。
方法:
1.标本采集：随机选择2018年1月～2019年1月无盆底功能障碍性疾病且因其他疾病行子宫切除的病人。取正常子宫宫骶韧带组织进行成纤维细胞培养。
2.成纤维细胞培养：采用胶原酶消化法对宫骶韧带成纤维细胞原代培养；采用差时贴壁法纯化成纤维细胞后传代培养；对细胞进行VIM免疫荧光染色，鉴定为成纤维细胞后进行转染。
3.慢病毒转染：构建WNK1慢病毒载体并转染成纤维细胞中。实验分为三组，WNK1+组：携有WNK1基因的慢病毒；试剂对照组：空载慢病毒；空白对照组：PBS溶液。
4.成纤维细胞增殖能力检测：显微镜下观察成纤维细胞的生长状态；CCK-8法检测成纤维细胞的增殖活性。
5.宫骶韧带成纤维细胞WNK1、COLⅠ及COLⅢ的表达：RT-qPCR及Western blot蛋白印迹法分别检测WNK1、COLⅠ及COLⅢ的mRNA及蛋白的相对表达量。
结果：
1.成纤维细胞的培养：经3代培养的成纤维细胞具备转染条件，显微镜下可见成纤维细胞相互融合成片，轮廓清楚，呈放射状、长索形、部分呈三角形，原代中有许多没有伸展的圆形细胞。复苏后的成纤维细胞生长状态良好，均可贴壁生长。通过VIM免疫荧光染色发现复苏后的细胞结果阳性表达，为成纤维细胞。
2.转染结果：WNK1+组中的WNK1蛋白表达量较空白对照组及试剂对照组显著升高，差异有统计学意义（P值分别为0.031、0.037）；试剂对照组的蛋白表达量与空白对照组相比差异无统计学意义（P=0.904）。
WNK1+组较空白对照组成纤维细胞数目较多，排列整齐，呈现长梭形、扁平星形或三角形；而试剂对照组较空白对照组成纤维生长状态无明显差异。
3.CCK-8实验结果：孵育12h后WNK1+组成纤维细胞的OD值与空白对照组相比无明显差异，P=0.087；孵育24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h后的WNK1+组成纤维细胞的OD值显著高与空白对照组，差异均有统计学意义（P值分别为0.005、＜0.001、0.047、＜0.001、＜0.001、＜0.001、＜0.001）；孵育12h、24h、36h、60h、72h、84h、96h WNK1+组与试剂对照组相比显著增高，均有统计学意义（P值分别为0.021、0.005、＜0.001、＜0.001、0.001、＜0.001、＜0.001）；孵育48h WNK1+组与试剂对照组相比差异无统计学意义（P值为0.052）；孵育12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h试剂对照组OD值与空白对照组相比无统计学意义（P值为0.322、0.902、0.466、0.945、0.210、0.466、0.248、0.436）。
4.RT-qPCR结果：WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量较空白对照组显著上升，差异均有统计学意义（P值分别为0.016、0.011、0.031）；WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量与试剂对照组对比显著上升，差异均有统计学意义（P值分别为0.009、0.009、0.037）；试剂对照组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的mRNA相对表达量与空白对照组比较无显著性差异（P值分别为0.666、0.852、0.891）。
5.Western blot检测结果：WNK1+组中的WNK1激酶、COLⅠ及COLⅢ的蛋白相对表达量高于空白对照组，结果均有统计学意义（P值分别为0.031、0.030、0.019）；WNK1+组WNK1、COLⅠ、COLⅢ的蛋白相对表达量与试剂对照组对比显著上升，差异有统计学意义（P值分别为0.037、0.021、0.030）；试剂对照组中WNK1激酶、COLⅠ及COLⅢ的蛋白的相对表达量与空白对照组相比无明显差异（P值分别为0.904、0.804、0.733）。
结论：
WNK1基因过表达不仅促进宫骶韧带中成纤维细胞增殖，而且促进成纤维细胞中COLⅠ、COLⅢ的合成，为POP的临床诊断和治疗提供了一定的理论依据。