论文部分内容阅读
目的:胃癌是全球第五大癌症,同时也是第四大癌症死亡原因,发病率和死亡率高居不下。我国胃癌患者占全球胃癌接近一半,主要原因是我国胃癌患者大多是进展期,复发转移风险高,预后很差。因此深入研究胃癌侵袭转移的具体途径和关键生物标志物,发现胃癌潜在的治疗靶点,对于胃癌的诊治具有重要意义,为临床决策的优化提供实验依据和新的思路。近年来,人们发现环状RNA（circRNA）在非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）领域的特殊性,以共价闭合环状结构大量存在于真核生物的细胞质中。主要由前体mRNA（precursor mRNA,pre-mRNA）的外显子反向剪接形成,不易被核酸外切酶降解,比线性RNA更加稳定。更重要的是,circRNA具有调控转录或转录后水平的功能。很多circRNA已经被证明在某些癌症中稳定差异表达,表明circRNA在癌症分子标志物方面具有很大潜力。目前人们认为circRNA主要通过四种作用机制影响疾病（包括肿瘤）的发生发展。其中,研究最多的是利用circRNA自身丰富的微小RNA（micro RNA,mi RNA）结合位点,充当mi RNA分子海绵,调控mi RNA下游靶基因的表达。这种调控机制也叫竞争性内源RNA机制（competing endogenous RNA,ceRNA）。众所周知,mi RNA可以结合mRNA导致下游靶基因沉默,而ceRNA可以通过竞争性地结合mi RNA来调节下游靶基因的表达模式。最常见的ceRNA为长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）和circRNA,可以通过结合mi RNA应答元件（micro RNA response element,MRE）,从而逆转mi RNA导致的基因沉默。Hsa＿circ＿0001190是一个尚未有实验报道的circRNA,位于21号染色体上,具有1568个碱基。其母本基因名为双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶A（Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulation kinase 1A,DYRK1A）,影响包括Erk和Akt在内的多个信号通路,与肿瘤的发生密切相关。而hsa＿circ＿0001190在胃癌中的潜在作用以及机制尚未可知,有待于进一步研究。因此,我们首先利用高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）进行生物信息学分析,证实hsa＿circ＿0001190在胃癌组织及癌旁组织中的表达存在显著差异。本研究目的在于通过体内体外实验,明确hsa＿circ＿0001190在胃癌中扮演何种角色,探索hsa＿circ＿0001190与胃癌临床病理特征的相关性,研究hsa＿circ＿0001190在胃癌中的作用以及内在机制,为胃癌侵袭转移的机制研究提供实验依据,也为基础研究向临床决策转化提供新的可能。方法:首先我们利用多种生物信息学分析方法,联合分析、筛选出GEO数据库中显著差异表达的circRNA,并对其进行结构可视化、功能预测以及通路富集分析。为了进一步验证候选circRNA对胃癌的影响,我们选取37对经病理确诊为胃腺癌的患者组织标本,提取癌与癌旁组织RNA进行RT-qPCR检测。除了验证新鲜组织标本中的hsa＿circ＿0001190表达量,我们还选取了120例接受根治性手术的胃癌患者石蜡切片,进行原位杂交实验,对该指标进行半定量分析,探究与胃癌患者的临床病理特征的相关性,利用多因素Cox回归分析和Kaplan-Meier生存分析观察是否与胃癌患者的生存预后显著相关。通过RT-qPCR实验检测5种胃癌细胞系中的表达量,选择MGC-803和HGC-27两种胃癌细胞系进行后续实验分析。利用慢病毒载体构建稳定过表达和沉默hsa＿circ＿0001190的细胞株,并用RT-qPCR实验验证表达效率。通过设计体内、体外实验,主要包括划痕愈合实验、Transwell实验、克隆形成实验、CCK-8增殖实验以及裸鼠皮下成瘤实验,观察hsa＿circ＿0001190在体内外对胃癌细胞侵袭、迁移、增殖情况的影响。我们拟对过表达hsa＿circ＿0001190的胃癌细胞进行高通量测序,探索hsa＿circ＿0001190影响胃癌细胞恶性生物学行为的具体通路,并明确ceRNA机制中的关键mi RNA分子以及下游靶基因。利用ENCORI、circ Bank、mi RDB和Target Scan Human等多个数据库联合预测分析,结合高通量测序结果,共同筛选出可能与hsa＿circ＿0001190结合的mi RNA以及下游靶基因。既往研究已经证实候选靶基因——磷酸酶及张力蛋白同源物（Phosphatase and tensin homolog,PTEN）能通过丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（又称作蛋白激酶B或PKB）通路抑制血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）表达,从而抑制肿瘤血管生成。所以我们合理推测hsa＿circ＿0001190通过竞争结合该mi RNA,阻止对下游靶基因的抑制作用,从而抑制肿瘤血管生成功能,最终发挥抑癌作用。通过利用双荧光素酶报告基因实验明确circRNA和mi RNA的结合位点。Western Blot实验检测过表达、沉默hsa＿circ＿0001190的胃癌细胞中所有下游靶基因的表达量,明确调控关系。为了进一步研究hsa-mi R-23a-3p是否参与hsa＿circ＿0001190的调控途径,在稳定过表达hsa＿circ＿0001190的MGC-803、HGC-27细胞中转染hsa-mi R-23a-3p,观察胃癌细胞的功能和蛋白水平变化。最后我们检测了胃癌细胞与人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）共培养体系中,内皮细胞的成管能力是否发生显著改变;并通过Rescue实验验证hsa＿circ＿0001190能否通过hsa-mi R-23a-3p影响下游蛋白表达,进而改变肿瘤血管生成功能,最终影响胃癌细胞恶性生物学行为。结果:1.生物信息学分析结果显示,在5个GEO数据集,共计36个胃癌患者高通量芯片数据联合分析中,共鉴定出39个circRNA显著差异表达。hsa＿circ＿0001190和hsa＿circ＿36287均在胃癌组织中显著低表达,癌旁组织中显著高表达（P＜0.05）。Cancer-Specific Circ RNA Database（CSCD）数据库检索到两个候选circRNA的二级结构,发现都含有大量mi RNA结合位点。2.进一步对37对胃癌患者癌和癌旁组织RT-qPCR实验分析,结果显示,hsa＿circ＿0001190和hsa＿circ＿0036287在癌旁中的表达量均显著高于肿瘤组织（hsa＿circ＿0001190:P＜0.001;hsa＿circ＿0036287:P=0.014）。3.RT-qPCR检测人胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、HGC-27、MKN-45和AGS中hsa＿circ＿0001190和hsa＿circ＿0036287的表达水平。实验结果显示,二者均在对照组GES-1中表达最高,MGC-803和AGS表达最低,其余依次为SGC-7901、MKN-45和HGC-27。但是hsa＿circ＿0036287的本底表达较低,不适合后续实验进一步分析验证。综上,我们选择hsa＿circ＿0001190作为靶点,MGC-803和HGC-27作为理想胃癌细胞系,并成功构建稳定过表达、沉默hsa＿circ＿0001190的细胞株进行下一步实验研究。4.原位杂交实验结果显示,hsa＿circ＿0001190主要表达于细胞胞浆内。对120例胃癌患者的临床病理特征进行相关性分析,我们发现hsa＿circ＿0001190表达与N分期（P=0.016）和淋巴结转移率（P=0.007）显著相关。低表达组患者N分期明显更晚,淋巴结转移率明显更高。Kaplan-Meier生存分析显示,hsa＿circ＿0001190高表达患者的生存预后显著优于低表达的患者（5年生存率:55.6%vs 19.7%,P＜0.001）。多因素Cox回归分析显示,hsa＿circ＿0001190高表达是胃癌患者预后较好的独立预测因素（HR=0.367,95%CI:0.227-0.596,P＜0.001）。5.体外功能实验结果发现,划痕愈合和Transwell实验中,hsa＿circ＿0001190能够通过显著抑制胃癌细胞侵袭迁移能力。但克隆形成和CCK-8细胞增殖实验显示,该circRNA对体外胃癌细胞增殖能力影响较小。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,注射hsa＿circ＿0001190过表达MGC-803的左侧腋下瘤体生长速度明显低于右侧对照组（P=0.035）;左侧腋下肿瘤重量显著小于右侧对照组（P=0.005）。6.高通量测序结果发现,mRNA差异分析提示,hsa＿circ＿0001190过表达后,PTEN、NCLP1、COL3A1以及RASIP1表达亦上调,与hsa＿circ＿0001190存在正调控关系,提示我们它们可能是下游靶基因;mi RNA差异分析提示hsa-mi R-23a-3p、hsa-mi R-191-5p等17个mi RNA表达下调,与hsa＿circ＿0001190存在负调控关系,提示我们这些mi RNA可能结合hsa＿circ＿0001190。进一步功能富集分析发现,相较于hsa＿circ＿0001190过表达组,NC组在血管生成相关通路明显富集,说明hsa＿circ＿0001190低表达可能促进肿瘤血管生成。7.ENCORI、circ Bank、mi RDB和Target Scan Human等多个数据库联合预测分析,结合高通量测序结果,共同筛选出关键mi RNA分子——hsa-mi R-23a-3p以及关键mRNA——PTEN。据此我们合理推测hsa＿circ＿0001190通过竞争结合hsa-mi R-23a-3p,逆转hsa-mi R-23a-3p对下游靶基因PTEN的抑制作用,从而抑制肿瘤血管生成,最终发挥抑癌作用。8.双荧光素酶报告基因实验结果显示,与WT+mi R（+）NC相比,WT+mi R（+）组荧光素酶活性显著降低（P=0.003）,而MT+mi R（+）NC与MT+mi R（+）组间荧光素酶活性无统计学差异（P＞0.05）。9.转染hsa-mi R-23a-3p mimics后,Western Blot检测发现,MGC-803、HGC-27细胞系中,过表达组与NC组比较,PTEN蛋白的表达都显著降低（P＜0.05）。10.Western blot检测发现hsa＿circ＿0001190过表达组的MGC-803以及HGC-27细胞PTEN表达均高于对照组（P＜0.01）。Akt蛋白表达,过表达组MGC-803细胞低于对照组,趋势明显,但并未显示统计学差异（P=0.072）;HGC-27细胞显著低于对照组（P=0.048）。VEGFA蛋白表达,过表达组的MGC-803以及HGC-27细胞均低于对照组（P＜0.05）。11.血管生成实验结果显示,当与hsa＿circ＿0001190过表达组MGC-803细胞共培养后,HUVEC成管能力显著降低（P＜0.01）;当与hsa＿circ＿0001190沉默组MGC-803细胞共培养后,HUVEC成管能力明显增高（P＜0.01）。过表达hsa-mi R-23a-3p细胞共培养HUVEC,成管能力显著增高（P＜0.05）。Rescue实验结果显示,HUVEC在与circ（+）+mi R（+）NC组MGC-803共培养后,其成管能力显著降低（P＜0.05）;HUVEC在与circ（+）NC+mi R（+）组MGC-803共培养后,其成管能力则显著增高（P＜0.01）;但是circ（+）+mi R（+）共转染组显示,共培养体系中HUVEC的成管能力相较于circ（+）NC+mi R（+）组显著降低（P＜0.01）。12.Western blot实验结果显示,在MGC-803与HGC-27细胞系中,与circ（+）NC+mi R（+）NC组相比,circ（+）NC+mi R（+）组PTEN表达明显降低（MGC-803:P=0.006;HGC-27:P＜0.001）,circ（+）+mi R（+）NC组PTEN表达明显升高（MGC-803:P=0.032;HGC-27:P=0.006）。而circ（+）+mi R（+）共转染组与circ（+）NC+mi R（+）组相比,结果显示PTEN表达明显增加（MGC-803:P=0.049;HGC-27:P=0.037）。结论:hsa＿circ＿0001190高表达与胃癌患者预后较好显著相关,通过竞争性结合hsa-mi R-23a-3p,从而使其靶基因PTEN表达水平上升,进而抑制PTEN下游基因Akt激活,使VEGFA蛋白表达下调,最终抑制胃癌血管生成等恶性生物学行为,发挥抑癌作用。