论文部分内容阅读
纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)能够在以结晶纤维素滤纸为唯一碳源的无机盐培养基中生长,并伴随着有效的细胞接触性的滤纸降解。纤维堆囊菌的纤维素降解特性是其生长发育的物质基础,是其产生生物活性物质的基础,是分离纯化的依据,也是其分类的重要依据。但目前对S.cellulosum降解纤维素这一特性的研究却鲜有报道。
实验室前期研究发现,S.cellulosum降解纤维素过程依赖于菌体与底物的相互接触,进而以完整洗涤细胞建立反应体系可检测到明显的内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性,表明其相关降解酶组分与细胞结合在一起。但其中的酶组分在菌体上的组织方式,仍没有得到明确解析。此外,酶组分与细胞的结合方式使得S.Cellulosum中纤维素酶、木聚糖酶等单酶组分的分离纯化非常困难,限制了对单酶组分生化性质的研究。本论文的工作在实验室对S.cellulosum So0157-2测序的基础上,通过对其木聚糖酶模块结构分析,结合已报道的S.cellulosum So ce56基因组中木聚糖酶结构模块的分析,以了解S.cellulosum中木聚糖酶模块结构的特征,推测其在木聚糖底物降解中的作用和方式,在菌株生长发育中的生理功能,体现S.cellulosum木聚糖降解过程的独特性。同时,对单个木聚糖酶组分通过基因克隆、异源表达获得重组活性蛋白,一方面可以对单酶的生化性质进行分析,另一方面可以为制各其对应的抗体提供材料,为研究S.cellulosum中木聚糖酶的空间分布奠定基础。
本工作首先对S.cellulosum So ce56及So0157-2中木聚糖酶模块结构进行分析,发现所有的木聚糖酶均不含有组成纤维小体酶类特有的锚定域。此外在两株菌基因组中未发现脚手架蛋白及脚手架蛋白特异的粘附域。这与纤维小体降解策略不符。另一方面,所有木聚糖酶中仅有少数几个含有CBM,并且含有CBM的木聚糖酶均是GH43家族。对于在木聚糖降解菌株中占比例巨大且研究较广泛的GH10、GH11家族木聚糖酶中却没有CBM的存在,仅So0157-2中GH11家族的contig00901-2有CBM,contig00016及contig00028中有功能相近的RICIN结构域。这与游离酶的降解策略有差别。此外,一个突出的特点是预测有高比例的木聚糖酶经过脂链的修饰。结合实验室前期对S.cellulosum的研究及纤维素酶特征的分析,发现S.cellulosum在降解纤维素、木聚糖过程中所采用的策略与目前研究广泛的游离酶及纤维小体两种策略均不相同。S.cellulosum在降解纤维素、木聚糖过程中可能采用自己独有的降解策略。
选择S.cellulosum So0157-2基因组中糖苷水解酶11家族的两个木聚糖酶基因,命名为Xyn11A和Xyn11B。进行了基因克隆和表达,获得了纯化的活性蛋白,开展了酶学性质研究。
将Xyn11A连入表达载体pET-22b,构建了重组质粒pET-22b-Xyn11A,在E.Coli BL21(DE3)中诱导表达,重组蛋白以包涵体形式存在,经过Ni亲和层析和尿素浓度梯度透析复性后得到了重组的活性目的蛋白(r-Xyn11A),进一步通过superdex20010/300 GL分子筛纯化后,得到电泳纯重组蛋白r-Xyn11A。酶学性质分析发现r-Xyn11A最适pH介于6.5-7.0;最适温度为45℃。在pH10.5的缓冲液中处理30min后,仍能够保留接近95％的活性,表现出一定的碱耐受性。R-Xyn11A不能耐受较高温度,在60℃反应时,酶活性便基本完全丧失。多种金属离子对r-Xyn11A有抑制作用,仅有少数几种离子(Li+、K+、Mg2+)能够微弱的促进r-Xyn11A的木聚糖酶活性。在0.1％SDS存在时,r-Xyn11A木聚糖酶活性为对照组的189.5％,并且在1％(36.7mM)SDS存在时,r-Xyn11A仍能表现出活性,而在水溶液中当SDS浓度达到7mM(约0.19％)时大部分蛋白便会变性从而失去活性。R-Xyn11A仅对实验测定的三种不同来源的木聚糖表现出降解活性。对桦木木聚糖的Km值为1.27mg/ml,Vmax为0.27mmolmin-1mg-1。R-Xyn11A作用于桦木木聚糖后产物包含多种低聚寡糖。R-Xyn11A为一耐碱性且具有SDS耐受性的内切型木聚糖酶。制备了抗r-Xyn11A抗体,为后续蛋白的细胞定位奠定了基础。
扩增得到了Xyn11B C端(131-350)包含催化结构域在内的序列(Xyn11B-C),将其连入表达载体pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-6P-1-Xyn11B-C。经过诱导条件优化实现可溶活性表达。对GST融合蛋白进行GST标签的切割纯化,得到电泳纯重组蛋白Xyn11B-C。酶学性质分析发现其最适pH为7.0;最适温度为40℃,在100℃进行反应时,其活力能达到最大活性的20％左右。Xyn11B-C对碱性环境具有较强耐受性,pH10.5的缓冲液中处理30min后,仍保留90％左右的酶活;温度稳定性表现出一定的特异性,60℃、70℃处理10min-1hr后酶活性严重丧失,但90℃处理1hr后酶活保留30％左右,100℃处理30min后酶活保留20％左右。多种金属离子及化学试剂对Xyn11B-C木聚糖酶活性具有抑制作用。Xyn11B-C仅对三种不同来源的木聚糖表现出降解活性。Xyn11B-C降解桦木木聚糖后产物为单一的木二糖,结合其对寡糖的降解,表明Xyn11B-C为一外切型木聚糖酶。将Xyn11B-C中可能的亚位点组成残基Y215突变为A,表达纯化重组蛋白Xyn11B-C-Y-A。其作用于桦木木聚糖后产物变为多种低聚寡糖,展现出内切酶特性,并且作用于寡糖时,除去具有降解酶活性外,也展现出了合成酶的功能。