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红麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生的韧皮纤维植物,具有强大的杂种优势,但前人尚未选育出在生产上有利用价值的雄性不育系和杂交种。2000年,周瑞阳教授在海南冬繁的红麻野生种UG93(引自中国农业科学院麻类研究所)中发现了雄性不育突变系UG93S;2008年,周瑞阳等选育出了世界上首个红麻“三系”杂交种“红优1号”。此后又在UG93品种群体中发现了能保持UG93S雄性不育系UG93B,并选育出了质核同源雄性不育系UG93A,为研究雄性不育核质互作提供了良好的材料。本课题组的前期研究表明,线粒体基因atp6与红麻CMS密切相关;以红麻atp6的CDS序列构建酵母bait载体,通过酵母双杂交文库筛选出了红麻转录因子HcMYC2a和HcMYC2b分别与ATP6互作,但是互作的核心区域尚不清楚。为了验证ATP6与HcMYC2a和HcMYC2b蛋白互作的功能区域,本研究采用Infusion DNA融合方法,以短截的atp6序列分别构建酵母bait载体,以短截HcMYC2a和HcMYC2b序列分别构建酵母prey载体。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术分别验证红麻ATP6与HcMYC2a和HcMYC2b互作的核心功能区域,得出如下主要研究结果:(1)以红麻UG93A和UG93B的cDNA为模板,采用Infusion DNA融合的方法分别构建短截的酵母bait重组载体,分别为pGBKT7-atp6A-1,pGBKT7-atp6A-2,pGBKT7-atp6B-1和pGADT7-atp6B-2;同时构建短截的酵母 prey 重组载体,分别为 pGADT7-HcMYC2a-1,pGADT7-HcMYC2a-2,pGADT7-HcMYC2b-1和pGADT7-HcMYC2b-2。(2)分别将上述酵母bait载体转化Y2H感受态,prey载体转化Y187感受态,通过对不同短截片段的重组质粒进行酵母双杂交检测,研究结果表明atp6A-2与HcMyc2b-1;atp6A-2与HcMYC2b-2;atp6B-1 与HcMYC2b-1 以及atp6B-2与HcMYC2a-1 杂交组合在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的培养基上长蓝斑,说明这些蛋白结构发生相互作用,其所代表的短截片段转录蛋白为互作的核心区域。(3)采用Infusion DNA融合方法构建C端双分子荧光互补载体pSPYCE-atp6A,pSPYCE-atp6B,pSPYCE-HcMYC2aa,pSPYCE-HcMYC2ab,pSPYNE-HcMYC2bb以及N端双分子荧光互补载体pSPYNE-atp6A,pSPYNE-atp6B,pSPYNE-HcMYC2aa,pSPYNE-HcMYC2ab,pSPYNE-H cMYC2bb。(4)将上述重组载体经不同的组合方式分别注射本氏烟草叶片,研究结果表明,ATP6A与HCMyc2bb;ATP6B与HCMyc2aa;ATP6B与HCMyc2ab;以及ATP6B与HCMyc2bb共同注射的烟草叶片均发射黄色荧光信号,表明这些蛋白在烟草叶片中发生互作。