断奶仔猪腹泻和水肿病是规模猪场危害最为严重的疾病之一,产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是造成断奶仔猪腹泻的主要病原菌,产Vero细胞毒素大肠杆菌(Verotoxigenic Escherichia coli, VTEC)则与仔猪水肿病密切相关。国外学者前期研究表明,α-(1,2)岩藻糖转移酶基因1(FUT1)与E.coliF18受体基因相连锁,可以作为控制E.coliF18粘附的候选基因。FUT1基因M307处存在G/A突变位点,并且G对A为显性,即AA基因型猪对E.coliF18表现为抗性,GG型和AG型表现为敏感性,并据此在国外猪种中实现了抗病育种。然而,在国内地方猪种中均未检测到FUT1基因M307AA和AG基因型个体,全部为GG基因型,呈极端偏态分布,由此可见,中外猪种在抗E.coliF18感染过程中具有不同的遗传机理。课题组在前期研究中利用在苏太猪群体中检测到的少量FUT1基因AG型个体进行适当选种选配,通过多年选育,已在苏太猪中建立了大肠杆菌病抗性(AA型)和敏感性(AG和GG型)资源家系群体。此外,课题组还构建了基于表达E.coli F18黏附素的V型分泌系统,并结合受体黏附试验技术,对资源家系群体E.coli F18抗性／易感性进行进一步的分析和验证。本研究基于建立的苏太猪E.coli F18抵抗性(AA型)和敏感性(AG和GG型)资源家系,利用基因表达谱芯片、蛋白质组学等相关技术对猪E.coli F18抗性候选基因进行了分析和筛选,以期揭示中国地方猪种抗E.coli F18的遗传基础,解决国内地方猪种E.coli F18抗性育种的关键科学问题。主要研究结果如下：1.运用表达谱芯片筛选大肠杆菌F18敏感型和抗性型两对比组间差异基因。(1)以Fold change绝对值大于2倍作为差异标准,在敏感型(GG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中,差异基因共13个,其中上调6个,下调7个；在另外敏感型(AG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中,共筛选出差异基因6个,其中上调4个,下调2个。(2)经GO分析可知,上述差异表达的基因涉及免疫应答、胞外区修饰(如糖基化)、细胞黏附、信号转导、转录调控、代谢等多个方面。通过KEGG数据库查询敏感型对抗性型差异基因所在通路以及文献挖掘,确定了与受体形成相关的鞘糖脂生物合成—球系列通路和炎症免疫通路对F18大肠杆菌病抗性具有调控作用,并将其作为下一步研究的重点。。(3)差异基因SLA-1、SLA-3、ST3GAL1、A基因,以及FUT1、TAP1和SLA-DQA基因通过荧光定量验证后与表达谱芯片结果一致,说明芯片结果可靠。2,对芯片结果炎症免疫通路中两个差异基因SLA-1与SLA-3在E.coli F18抗性组和敏感性组间进行表达比较及分析。(1)运用3个内参基因对SLA-1与SLA-3基因表达水平进行均一化。组织表达谱结果表明,SLA-1与SLA-3基因在11个组织中均表达；SLA-1在肺、免疫器官如脾、胸腺、淋巴结以及消化器官胃、十二指肠、空肠中的表达量相对较高；SLA-3基因在肺和淋巴结中的表达量较高,在心、肝、脾、肺、胃、肌肉、胸腺、十二指肠和空肠中的表达量较低。(2)SLA-1与SLA-3基因在E.coli F18抗性组大部分组织,如脾、肺、胃、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠中的表达量相对较高,但是与敏感性组之间的表达差异不显著。(3)线性相关关系分析显示,SLA-1与SLA-3基因在E.coliF18抗性组脾、肺、胃、胸腺、淋巴结、十二指肠和空肠等表达较高组织中的表达量呈现弱的正相关。而在E.coliF18敏感组,SLA-1与SLA-3基因在组织淋巴结中的表达量呈现弱的负相关；在组织胃、胸腺、十二指肠和空肠中呈现强烈的正相关,在组织脾和肺中呈现弱的正相关。(4)经GO和Pathway功能分析显示,SLA-1与SLA-3基因均参与了37个生物学过程,主要涉及抗原递呈和免疫应答的调控,并涉及9个通路,其中5个通路与免疫功能相关。3,对芯片结果中鞘糖脂生物合成—球系列通路中所有基因在个体不同组织中的表达,尤其针对肠道组织进行全面的分析。(1)组织表达谱结果显示,FUT1、FUT2、ST3GAL1、HEXA、HEXB、B3GALNT1和NAGA7个基因在所检测的11个组织中均表达,总体来看,所有基因在肝、肺、肾、胃中表达量较高,其次为十二指肠和空肠,在脾、胸腺和淋巴结等免疫组织中的表达量较低,在心和肌肉中的表达量最低。(2)7个通路基因在E.coli F18抗性组和敏感组个体十二指肠和空肠组织之间表达进行比较显示,在十二指肠中,FUT1和NAGA基因在E.coli F18抗性型个体的平均表达量高于敏感型个体；其余5个基因则在E.coli F18敏感性组中的表达量相对较高,差异倍数达2倍以上的有ST3GAL1基因。在空肠组织中仅FUT1基因在E.coli F18抗性型组中的表达量高于敏感组；其余6个基因均在敏感组中的表达量较高,差异倍数达2倍以上的有FUT2、HEXA和NAGA基因。(3)7个通路基因在苏太猪E.coli F18抗性个体十二指肠组织和空肠组织相关性分析表明,在苏太猪E.coli F18抗性个体十二指肠组织中,FUT1基因与HEXA、HEXB和NAGA基因,FUT2基因与ST3GAL1基因,ST3GAL1基因与HEXA、HEXB和B3GALNT1基因之间均表现为弱的负相关；其余基因之间均表现为弱的正相关。在苏太猪E.coli F18抗性个体空肠组织中,FUT1基因与ST3GAL1、HEXA和NAGA基因,FUT2基因与ST3GAL1基因,ST3GAL1基因与HEXA、HEXB和B3GALNT1基因之间均呈现弱的负相关,其余基因之间均表现为弱的正相关。(4)7个通路基因在苏太猪E.coli F18敏感性个体十二指肠组织和空肠组织相关性分析表明,在苏太猪E.coli F18敏感性个体十二指肠组织中,NAGA与另外6个基因FUT1、 FUT2、ST3GAL1、HEXA、HEXB以及B3GALNT1均呈现弱的负相关；另外,FUT1基因与FUT2、HEXB、B3GALNT1呈弱的负相关。除FUT2与B3GALNT1两基因间呈显著正相关外(P<0.05),其余基因之间均呈现弱的正相关。通路基因在苏太猪E.coli F18敏感性个体空肠组织中,NAGA基因仅与FUT1、FUT2基因呈现弱的负相关。其中,FUT1与FUT2、 HEXB, FUT2与HEXB、B3GALNT1, HEXB与B3GALNT1间均表现为显著正相关。4,运用差异蛋白质组学筛选大肠杆菌F18菌株敏感型和抗性型两对比组间差异蛋白。(1)在E.coli F18敏感型和对抗性型配对组中,发现20个蛋白点在表达量上有显著变化,其中10个点在E.coli F18抗性组中高表达,10个点在E.coli F18敏感组中高表达。(2)对两组之间呈现的20个差异蛋白质进行ESI-MS/MS分析,成功对16个蛋白斑点进行了肽指纹图谱的测定,共确定为12种蛋白质,其中2287、2589和2484,2074、1967和1912斑点分别呈现同一种蛋白,即actin, alpha2(ACTA2)和albumin (ALB)。另外10个有意义的差异蛋白分别为在E.coli F18抗性组中上调的Transferrin (TF)、similar to collapsin response mediator protein-2A (LOC100151886)、ribosomal protein SA (RPSA)和similar to AGAP005293-PA (LOC100153507)4种蛋白,以及在E.coli F18敏感组中上调的vinculin (VCL)、aconitase2(ACO2)、actin, alpha, cardiac muscle1(ACTC1)、actin beta (ACTB)、 heat shock protein27kDa (HSP27)和smooth muscle protein22-alpha (SM22A)6种蛋白。(3)对差异蛋白进行GO分析可知,在已知功能的基因中,显著性功能包括了肌肉收缩、细胞表面蛋白定位、胞外刺激应答、激活MAPKK等多个方面。通过KEGG数据库查询差异蛋白对应基因的所在通路,结果中包括有肌动蛋白细胞骨架的调控、黏着连接、白血球经内皮迁移、黏着斑等。(4)基于KEGG数据库现有信息,结合所有显著性Pathway中所属的蛋白,构建了差异蛋白间相互作用网络图。由于本实验结果获得的差异蛋白数量较少,以及数据库中信息的有限性,网络图中只包含5个差异蛋白(其余为连接蛋白),分别为：ACO2、 LOC100151886、ACTC1、VCL、HSP27,并且以上5个蛋白都处于网络的最下游,有着特殊重要的地位。结合对差异蛋白的功能分析,表明ACTB、VCL、转铁蛋白和热应激蛋白(HSP)与断奶仔猪F18大肠杆菌的抗性调控密切相关。