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大肠杆菌硝基还原酶是一种以FMN为辅基且依赖于NAD(P)H的氧不敏感型黄素蛋白，能够催化多种硝基底物的还原，在生物转化、生物修复和前药激活等方面应用广泛。目前已获得3种大肠杆菌硝基还原酶，分别为NfsA、NfsB和YdjA，其中NfsA与研究较为深入的NfsB底物谱和结构特点类似，但它们分属硝基还原酶GroupA和GroupB家族，氨基酸序列一致性很低，在辅酶偏好和底物区位选择性还原等方面表现出明显的差异。为了解NfsA的催化性质，本论文开展以下工作: (1)利用NCBI中提供的NfsA的序列(GenBank: BAA07425.1)设计引物，从E.coli K12菌株中获取nfsA基因，将其克隆至pET28a，转化至E.coli BL21(DE3)中，经表达条件优化，获得高表达的重组酶，利用亲和层析获得纯化酶。 (2)比较NfsA和NfsB的晶体结构，发现Phe42在NfsA中存在，在NfsB中缺失。为了探索Phe42对NfsA的作用，通过PCR定点突变获得三个突变体F42Y、F42N和F42A。以呋喃西林为底物检测突变体的酶活力变化，发现活力较野生型分别下降51.7％、96.3％和98.7％。测定了NfsA与突变体对辅酶NADPH以及底物NFZ、CB1954、TNT和2，4-DNT的动力学数据，其中NfsA对于NFZ的亲和力最大，Km值为12μM，其次是TNT，Km值为29μM。比较野生型和三个突变体的动力学数据，发现突变体的Km基本不变，而kcat显著降低，并导致kcat/Km显著降低。通过远紫外圆二色谱分析突变体与NfsA的二级结构，发现F42N和F42A在波长208 nm到222 nm之间，椭圆度显著改变，说明螺旋含量减少，酶的二级结构改变，而F42Y基本不变。上述研究表明，Phe42对于维持NfsA的酶活力和二级结构发挥很重要的作用。 (3)比较GroupA家族和GroupB家族的氨基酸序列，结合晶体结构和氨基酸性质分析，推测Arg15、Lys167和Arg203可能是NfsA中与NADPH结合的关键氨基酸。对其分别进行突变，获得突变体R15A、K167A、R203A和R203D。测定了突变体利用两种辅酶NADH和NADPH时催化活性和动力学常数。结果表明，四个突变体利用NADPH的催化活性显著降低，且K167A、R203A和R203D降低了酶对NADPH的亲和力，说明它们与NADPH的结合有关。K167A提高了酶利用NADH的催化活性，推测其可能影响辅酶偏好性。 综上，本论文克隆表达了大肠杆菌硝基还原酶NfsA，并初步确定了影响其催化活性、辅酶结合及偏好性的关键氨基酸。