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脯氨酸内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP)属于丝氨酸蛋白酶家族中的一种特殊的切割多肽链中脯氨酸残基羧基端的内切酶,广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内。PEP参与生物体的多种生理、病理过程,并在医药领域得到了一定的应用。但是,国内外对于鱼类PEP的研究报道还比较少,特别是PEP如何参与鱼类肌肉生理变化过程还未见报道。鉴于此,本研究从蓝圆鲹肌肉中分离纯化出PEP并对其性质进行了相关研究,进一步探索了PEP的内源性抑制剂,以期为揭示脯氨酸内肽酶在鱼类肌肉中的功能特性奠定理论基础。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephacel阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose疏水层析和Q-Sepharose阴离子交换层析等方法从蓝圆鲹肌肉中分离纯化得到一种脯氨酸内肽酶。SDS-PAGE结果显示蓝圆鲹PEP分子量约为82 ku。对PEP的肽指纹质谱分析得到169个氨基酸残基,与墨西哥鲷鱼(Neolamprologus brichardi)PEP的同源性为98.8%,证明纯化的蛋白为脯氨酸内肽酶。酶学性质分析表明,PEP的最适温度和最适pH分别为35℃和6.0,且在低温与pH5.0-7.5范围内较稳定。通过热失活动力学方法测定该酶表观热失活速度常数可知,在一定的温度范围内,随着温度的升高,酶促反应速度提高,酶失活所需要的时间也变短。底物特异性研究显示PEP能够特异分解肽链羧基端含有脯氨酸残基的荧光底物,而对其他底物则基本不分解。PEP的特异性抑制剂SUAM-14746和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF可有效抑制PEP的活性,而其他蛋白酶抑制剂则对PEP没有抑制作用,表明PEP是一种特异性的丝氨酸蛋白酶。将蓝圆鲹PEP分别与三个合成的鱼类胶原蛋白小肽进行反应,利用反相高效液相色谱进行分离,结果显示PEP能够水解分子量小于30个氨基酸残基的胶原蛋白小肽。电喷雾质谱分析结果显示PEP的水解位点位于脯氨酸残基的羧基端。因此推测,PEP参与到鱼肌肉生理变化过程中,协同金属蛋白酶,通过特异性切割脯氨酸残基的羧基端降解胶原蛋白小肽。PEP是与鱼胶原蛋白新陈代谢密切相关的一种重要蛋白酶。圆二色谱扫描结果显示,PEP是一种以β折叠为主的蛋白质。进一步通过热处理、硫酸铵盐析、Q-Sepharose阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析和Capto Q阴离子交换层析等步骤从蓝圆鲹肌肉中分离纯化出一种PEP的内源性抑制剂。SDS-PAGE显示其分子量约为16 ku。对其进行了两次肽指纹质谱分析,结果与半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)核苷二磷酸激酶A和无须鳕鱼(Macruronusnovaezelandiae)核苷二磷酸激酶B同源性分别达到100%和94%,表明所纯化的PEP内源性抑制剂是核苷二磷酸激酶。该抑制剂具有较好的热稳定性和pH稳定性,在高达100℃下加热30 min抑制活性也可以保持70%以上。在pH 4.0-12.0的范围内抑制活性变化很小,但在pH<3.0的条件下稳定性变差。该抑制剂对PEP有竞争性可逆抑制作用,但对其他类型蛋白酶没有抑制效果。本研究揭示了核苷二磷酸激酶这一多功能蛋白质可以作为PEP内源性抑制剂的重要事实,为深入研究两者之间的作用关系奠定了基础。