目前果树品种改良主要依靠常规育种方法。长童期的存在严重制约了品种改良进程，同时也直接影响它的经济效益。童期的一个最基本特征是实生苗不具备开花能力，因此如何提早果树开花成为果树育种急需解决的关键问题之一。 关于果树开花的研究，目前主要集中于生理生化基础、环境因子和栽培技术措施对实生苗开花的影响，但对果树开花的分子机制及其遗传控制的研究仍处于“瓶颈”状态，迄今为止尚未见有相关报道。 花发育的研究在模式植物拟南芥菜上得到了空前的发展，利用拟南芥菜的突变体已定位了影响开花时间的约80个位点，并克隆到了许多与开花诱导相关的基因，并初步构建了花器官发育过程的遗传模型。其中一些基因促进开花，另一些抑制开花；其中LEAFY基因是一个促进营养分生组织向花分生组织转变的花分生组织特征基因，它已被证明是一个开花“开关”，是花形成最早的标记基因，其过量表达能促进拟南芥、烟草和欧洲山杨等植物提早开花。LEAFY及其同源基因在结构上高度保守、功能也比较相似。 本实验以柑桔和葡萄为材料，从基因克隆和基因转化两方面着手，研究提早果树开花的分子生物学基础，寻找促进果树早开花的有效快捷途径。 基因克隆方面： 采用Uneven PCR技术获得LFY同源基因片段csLFY9903。采用根据已知的不同种植物LEAFY同源基因3’序列的高度同源性，设计合成两个简并引物，与12个十聚体随机引物分别作用，采用Uneven PCR技术从大三岛基因组DNA中分离出一条长度约为1.3Kb的LFY同源基因片段（csLFY9903），序列测定表明，简并引物一端568kb与本实验室先前得到的另一长883bp的片段部分重叠且互相吻合，随机引物一端测得541bp，此区为高G+C含量。登陆基因库中检索结果发现该片断与烟草中的LFY同源基因NFL的同源性高达90％； 利用改良法筛选文库得到了LFY同源基因片段csLFY9914。本实验用PCR扩增结合铺噬菌体平板法筛选基因组DNA文库。按噬菌体浓度梯度铺噬菌体平板，用一对特异性引物进行PCR扩增，保留标记了的阳性噬菌体菌液，进行下一轮筛选，直至验证筛选得到单个阳性噬菌斑，扩大繁殖并保存。以特异片段为探针进行原位杂交，筛选到含有目的基因的单个噬菌体。根据入噬菌体结构特性，分别用 XhOI单酶切、Xh＊和 Notl双酶切，结合图谱分析得到的是部分插入的LFY基因片段。亚克隆后连接到pBS质粒中，得LFY同源基因片段CSLFY99。序列测定结果反应仍然是终止在 342hp后的高 G＋C区，且这段序列与用 Uneven PCR得到的克隆片段序列互相重叠。在已知的 342hp序列中不存在内含子，且根据外显子序列推导的氨基酸序列与已知的其它几种植物LEAF’Y及其同源基因的同源性高达80－98％，核昔酸序列达88％左右。 基因转化方面： 建立了葡萄高效稳定的离体再生系统，为开展LFY基因对葡萄遗传转化研究奠定基础。分别采用叶片和带芽茎段为外植体，接种于添加相同成分的培养基 GS＋ZT（2＊ mg／L）＋IBA（．ling／L）OH6＊）中，25 C，光照强度约 2000一3000LX，光暗周期为16h／sh条件下培养二周后，发现叶片做外植体以生根为主，且根系长势很好，而以带芽茎段为外植体则可诱导成完整植株，且根、茎生长平衡且长势良好。实验使用了 ZT和 6—BA两种细胞分裂素，同时使用了＊、NAA和 IAA三种生长素，不同激素配比对茎段继代 10天后生长情况的影响表明，培养基 GS＋ZT（2＊ mg／L）＋IBA（0二 mg／L）（pH6＊－6．二冲激素比例既适合茎段增殖，也利于根系生长，后续实验的基本转化培养基。此外，根据资料还建立了高效稳定的柑桔再生体系。 利用己知全序列的拟南芥菜LEAFY基因序列，设计合成两个特异性引物。利用冻融法，将携带有拟南芥的LEAFY全长CDNA基因的载体pDC202，转化到土壤农杆菌 GV31 03中，用叶盘法转化葡萄和柑桔再生体系受体植株的带芽茎段和子叶，通过初步抗性筛选、及包括PCR方法、Southern杂交等分子生物学方法检测，成功地得到了转基因植株；葡萄和柑桔两种果树受体植物转化拟南芥菜LEAFY基因后，都具有较高的转化频率，其转化芽再生频率分别为3．8％和2．5％。 利用微体嫁接方式初步解决了柑桔转基因植株生根难的问题。整个实验过程要求严格，为避免由于人为、自然因素而导致得来不易的转基因植株嫁接失活，本实验在微体嫁接支持物的选用上做了适当改进，用与试管口等大的灭菌海锦做支撑物，既可起稳定支架作用，又可保证植株吸收充分的液体营养物质供其生长，同时极大地避免了操作过程中的污染。成功的得到了转基因植株的微体嫁接苗。