【摘 要】
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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.）为唇形科鼠尾草属植物,是一味具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痛等功效的传统中药,常被用于治疗胸痹心痛、月经不调以及心脑血管等疾病,用途广泛,是我国常用的大宗药材之一。因其生长速度快、基因组小、世代周期短,且组织培养技术以及遗传转化体系日渐成熟,被认为是理想的药用模式植物。丹酚酸B（salvianolic acid B,SAB）是丹参中重要的
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丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.）为唇形科鼠尾草属植物,是一味具有活血祛瘀、通经止痛、凉血消痛等功效的传统中药,常被用于治疗胸痹心痛、月经不调以及心脑血管等疾病,用途广泛,是我国常用的大宗药材之一。因其生长速度快、基因组小、世代周期短,且组织培养技术以及遗传转化体系日渐成熟,被认为是理想的药用模式植物。丹酚酸B（salvianolic acid B,SAB）是丹参中重要的植物次生代谢产物,对自由基有较强的清除能力,具有抗炎、镇痛和抗氧化的作用,其生物合成途径受到人们的广泛关注。4-羟基苯丙酮酸双氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD）是丹酚酸生物合成途径中酪氨酸合成支路上的旁路基因,用于催化尿黑酸（Homogentisic acid）的形成,对丹酚酸的代谢积累起调控作用。为了满足药用市场对丹酚酸类化合物日益增长的需求,本研究以山农丹参1号无菌苗为试验材料,利用CRSIPR/Cas9基因编辑技术,针对Sm HPPD基因设计6个sg RNA,并成功构建6个相应的CRISPR/Cas9敲除载体。通过发根农杆菌ACCC10060介导转化丹参叶片,逐步培养获得Sm HPPD基因缺失的毛状根材料。利用PCR扩增检测,敲除载体均已整合到各丹参毛状根体内,共获得17株转基因阳性毛状根,转化效率为77.27%。经DNA测序结果分析:一共有7株阳性毛状根在相应的靶点位置发生突变,其中6株为嵌合突变,1株为双等位突变,突变类型包括替换和缺失,编辑效率为41.18%。采用q RT-PCR检测Sm HPPD基因在编辑株系中的表达水平,均显著低于对照株系,其中H3-2、H4-1、H4-2最为明显,分别降低了86.1%、81.18%、86.96%。进一步对编辑株系进行UPLC检测,以观察酚酸类及丹参酮类化合物的变化,结果显示,编辑株系中迷迭香酸和丹酚酸B化合物含量均显著高于对照株系,其中H3-2株系变化最为明显,为对照的2.85倍和2.38倍,丹参酮类物质没有显著差异,可见敲除Sm HPPD基因可有效增加酚酸类代谢物含量。本试验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除丹酚酸合成的旁路基因Sm HPPD,通过降低该基因的表达来减少竞争旁路的合成代谢,从而促进丹酚酸类化合物的积累,获得Sm HPPD基因缺失的毛状根材料。验证了Sm HPPD基因对丹酚酸类化合物合成的影响,提高了酚酸类化合物含量,将CRISPR/Cas9基因编辑技术成功应用于丹参毛状根实验室生产中,对丹参品种的改良提供了一种有潜力的方法。
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