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木薯块根富含淀粉,淀粉作为主要的粮食,是热带地区5亿人口的主粮。木薯具有极高的光合效率和库强,但木薯块根中碳水化合物的积累含量远远低于其理论产量。研究木薯淀粉在源库之间的转运效率,对于培育高产、高淀粉含量的木薯品种具有重要的意义。植物转化酶是蔗糖代谢的关键酶,该酶调控光合产物从韧皮部运输至块根中,能够影响淀粉在源库的转化率。碱性/中性转化酶基因MeNINV1在木薯块根淀粉积累的各时期的表达量较高,因此我们推测它是木薯块根蔗糖分解代谢关键基因。对碱性/中性转化酶MeNINV1的功能进行深入研究,将有利于我们对碱性/中性转化酶调控木薯块根蔗糖代谢机制的解析,为培育高产、高淀粉的木薯品种提供理论依据,同时也能筛选高淀粉产量的转基因木薯。本研究利用PCR技术,克隆得到MeNINV1的启动子,对启动子进行生物信息分析,并研究了不同激素对MeNINV1的表达调控,进一步在酵母转化酶突变体中验证其转化酶活性并且分析MeNINV1的酶学特性,最后利用CAM35S启动子,在木薯中过量表达MeNINV1基因,分析其亚细胞定位及对木薯碱性/中性转化酶活性的影响。主要研究结果如下:1.根据已知的木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeNINV1基因序列信息设计引物,利用PCR技术从木薯基因组中克隆得到MeNINV1基因上游1714 bp启动子序列。通过PLACE在线软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子其包含TATA box和CAAT box保守元件、大量光反应相关元件和受赤霉素调控的P-box元件、脱落酸应答元件ABRE、乙烯响应元件ERE等和水杨酸响应元件TAC-element等激素响应相关元件。2.对MeNINV1基因启动子的生物信息学分析,根据其上可能存在的激素调控的.顺式作用元件信息,选取30 μM GA3、30 μM ABA、100 μM SA和1%乙烯利四种外源激素处理SC8木薯组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNI-NV1基因的表达受激素诱导调控,推断木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子存在受激素诱导下表达变化有关的相对应顺式作用元件。3.利用酵母转化酶突变株SEY2102,验证了 MeNINV1具有转化酶催化蔗糖分解的功能。在酵母中表达MeNINV1,对其酶学特性进行研究,发现该转化酶最适pH为6.5,最适反应温度为40℃,在200mM的以内的蔗糖浓度对该酶没有明显抑制作用。用蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖验证MeNINV1对底物专一性,结果表明该酶只能分解蔗糖。MeNINV1酶活性受到产物果糖的抑制。有机化合物Tris,钙、镁、锰、锌和铅离子等金属离子和部分化学试剂对酶活性起到明显的抑制作用。4.预测MeNINV1亚细胞定位在线粒体或者质体,将植物表达载体pCAMBIA1300-MeNINV1-GFP转化烟草和木薯脆性愈伤组织,转基因烟草叶片和转基因木薯叶片细胞中证实MeNINV1定位于叶绿体中。在木薯中过量表达MeNINV1基因,qRT-PCR分析发现,转基因木薯叶和根中MeNANV1的表达量提高,同时测定转基因木薯叶片和根中的碱性/中性转化酶活性、还原糖和葡萄糖含量,结果表明,其叶片和根中的碱性/中性转化酶活性、还原糖和葡萄糖含量均有提高。